李超燕，于 琨，朱海華，張玉娟，顧偉禎，鄭文明，許 君

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450002)

法尼醇X 受體(Farnesoid X receptor α，F(xiàn)XRα)是一種肝富集膽汁酸受體，屬于核受體超家族成員，在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的代謝方面具有重要功能，是潛在的肝部疾病治療的靶標(biāo)分子。類法尼酯X受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR/NR1H4)屬于配體以來的核轉(zhuǎn)錄因子，其在肝臟、腸道、腎臟及腎上腺中高表達(dá)［1-4］。膽汁酸是FXR的天然配體。FXR不僅調(diào)節(jié)甘油三酸酯、膽固醇及葡萄糖的代謝、調(diào)節(jié)膽酸的生物合成及其肝腸循環(huán)，而且參與肝癌和腸癌進(jìn)程［5-9］。已知有2種FXR基因，分別為FXRα和FXRβ。在人類和嚙齒類動物中，由于啟動子的不同和RNA的選擇性拼接，F(xiàn)XRα基因編碼4種FXRα 異構(gòu)體(FXRα1，F(xiàn)XRα2，F(xiàn)XRα3，F(xiàn)XRα4)，F(xiàn)XRa或者以單體的形式，或者以FXR/視黃醇X受體(FXR/RXR)異二聚體的形式與一大類的FXR反應(yīng)元件結(jié)合，激活或者抑制這些元件。FXR在人類和靈長類動物中是假基因［10，11］。FXR最初作為膽汁酸受體被廣泛研究，近年來，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FXR是多功能核受體，通過與配體結(jié)合，激活一系列基因，從而調(diào)節(jié)膽汁酸、脂質(zhì)、碳水化合物的代謝，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，并保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝臟再生、抑制肝纖維化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，綠茶茶多酚EGCG是核受體FXRα的調(diào)節(jié)劑，為了深入研究EGCG對FXRα影響的機(jī)制，本研究克隆了FXRα核受體基因，成功構(gòu)建FXRα基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)獲得了FXRα蛋白并制備了多克隆抗體，為后期研究其與EGCG的相互作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞系由中國科學(xué)院武漢病毒所提供。大腸桿菌 (E.coli)菌株DH5a、BL21和pET-28a載體由河南農(nóng)大生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。pMD19-T載體購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司，RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA片斷回收試劑盒購自康為生物有限公司。卡那霉素、氨芐青霉素等購自鼎國生物工程公司，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 復(fù)蘇人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，在含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中37℃ 、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)之對數(shù)細(xì)胞生長，收集細(xì)胞，用TRIzol試劑盒提取mRNA。以O(shè)D260:OD280=1.8～2.0為標(biāo)準(zhǔn)檢測RNA的純度。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色來檢測RNA的提取質(zhì)量，用DNA酶I酶解消除基因組DNA的污染，純化后的樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 FXRα基因克隆與載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI GeneBank報道的FXRα的CDS核苷酸序列，該區(qū)為FXRα基因的ORF區(qū)。設(shè)計PCR引物，并在引物兩端加上所選擇的酶切位點(diǎn)，上游引物FXRα-F:GGATCC-ATGGGATCAAAAATGAATCTCAT，下游引物 FXRα-R:CTCGAG-TCACTGCACGTCCCA GATTT。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用rTaq PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL，按說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，循環(huán):94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，試劑盒回收DNA片段。

經(jīng)回收純化的DNA與pMD19-T載體于16℃過夜連接反應(yīng)，連接物CaC12轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp、IPTG和X-gal的LB平板上37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取白色菌落搖菌12～16 h后提取質(zhì)粒，篩選重組子。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切驗(yàn)證為正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果與原始序列一致的陽性質(zhì)粒命名為pMD19-T-FXRα。

pMD19-T-FXRα及pET-28a分別用BamH I和Xhol I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別回收相應(yīng)片段，T4DNA連接酶于16℃ 過夜連接pET28a和FXRα。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，在含卡那霉素平板篩選培養(yǎng)。菌落PCR和雙梅切驗(yàn)證陽性質(zhì)粒pET-28a-FXRα。

1.2.3 FXR重組蛋白的原核表達(dá)與純化 將pET-28a-FXRα 轉(zhuǎn)化 E.coil BL21(DE3)菌株，菌落PCR鑒定陽性克隆。挑陽性單菌落接入含卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，至OD600達(dá)0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，12 000 r·min-1離心收集菌體，加入1 mL的Binding Buffer重懸菌體，超聲波破碎收集沉淀和上清，ddH2O重懸沉淀，分別對上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，將大量誘導(dǎo)的菌體重懸于PBS(50 mmol·L-1Tris·HCl;pH 值 8.0;2 mmol·L-1EDTA)。低溫超聲破碎，離心后，沉淀用含6 mol·L-1鹽酸胍的Binding Buffer重懸2次超聲破碎，破碎后離心，將上清過Ni-NTA樹脂進(jìn)行純化。SDSPAGE檢測純化蛋白，將純化蛋白稀釋至0.5 g·L-1。4℃冰柜中透析復(fù)性，并超濾濃縮，SDSPAGE檢測復(fù)性蛋白。

1.2.4 抗體制備與效價測定 將純化復(fù)性后的重組蛋白(600 g·L-1)，與弗氏完全佐劑1∶1混勻，總量為1 mL的混合物多點(diǎn)注射新西蘭白兔背部。1次免疫7 d后2次免疫。2～3周后以弗氏不完全佐劑3次免疫。7 d后在兔子耳動脈取血。收集血清于37℃放置2 h后，4℃過夜，10 000 r·min-1，4℃離心10 min，收集血清，分裝并-80℃保存。將不同蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)PVDF膜，Western Blot檢測抗體特異性。

采用免疫斑點(diǎn)法檢測抗體效價，分別將10、100、1 000 ng抗原滴加到NC膜上，膜37℃烘干后，封閉液搖動封閉1 h，TBST洗膜3次后，將稀釋度分別為1 000、2 000、4 000、8 000、12 000 倍的抗血清加入已點(diǎn)樣的NC膜，37℃孵育2 h，TBST洗3次，HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 HepG2 RNA 提取

以HepG2為材料提取RNA，然后用DNaseI消化以去除基因組DAN污染并純化消化過的RNA。純化后的RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其純度及完整性。從圖1-A中知:28 S及18 S 2條RNA主帶清晰明亮，具有較高純度及完整性，可用于反轉(zhuǎn)錄。

2.2 PCR 擴(kuò)增 FXRα

以HepG2細(xì)胞系中提取的RNA為模板，采用RT-PCR方法克隆FXRα基因獲得。在1.0 kb與2.0 kb之間有1條大小與目的基因一致，約1 539 bp的條帶，表明已克隆得到目的基因，結(jié)果如圖1-B。

2.3 克隆載體與表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物切膠回收，與pMD19-T過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。挑取單克隆過夜搖菌后，菌液PCR鑒定陽性克隆，并將其命名為pMD19-T-FXRα，提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I、Xhol I酶切驗(yàn)證(圖2)，結(jié)果表明插入基因大小正確，與理論設(shè)計一致。

圖1 細(xì)胞HepG2 RNA檢測與FXRα PCR擴(kuò)增Fig.1 The agarose gel electrophoresis of RNA extraction and RCR products of FXRα specific primers

圖2 重組克隆載體pMD19-T-FXRα雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of the recombinant pMD19-T-FXRα by double digestion

2.4 重組表達(dá)載體酶切驗(yàn)證

質(zhì)粒pMD19-T-FXRα與pET-28a分別酶切后，pMD19-T-FXRα回收小片段，pET-28a回收大片段?；厥债a(chǎn)物經(jīng)過夜連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α。挑取單克隆過夜搖菌，菌液PCR鑒定陽性克隆，并將其命名為pET-28a-FXRα。提取質(zhì)粒，雙酶切后電泳檢測，結(jié)果表明:基因插入正確，與理論設(shè)計一致。結(jié)果如圖3。

2.5 FXR α重組蛋白的原核表達(dá)及純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子量58.6 kDa處有1條很明顯的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，而空載體則無此條帶;菌體經(jīng)超聲破碎后，沉淀中有明顯的特異條帶，而上清中沒有(圖4-A)，表明重組蛋白質(zhì)以包涵體形式表達(dá)為主。收集表達(dá)的菌體，超聲破碎后的沉淀用含鹽

圖3 重組克隆載體pET-28a-FXRα雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of the recombinant pET-28a-FXRα by double digestion

酸胍的Binding Buffer溶解沉淀，再次超聲波破碎，離心，濾膜過濾，鎳柱孵育，洗滌，洗脫，收集目的蛋白，復(fù)性后的純化蛋白SDS-PAGE電泳檢測。在66.4 kDa與44.3 kDa之間有1條帶，符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果，為目的條帶(圖4)。

2.6 多克隆抗體的制備與效價測定

FXRα蛋白免疫新西蘭白兔制備出的多克隆抗體，采用Western Blot鑒定其特異性。結(jié)果顯示，在大小為58 kD的位置有一特異性條帶，說明抗體制備成功。采用HRP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)方法測定效價，與陰性對照相比，所制備的多克隆抗血清稀釋至8 000倍時，依然可以清楚地觀察到雜交斑點(diǎn)，稀釋至12 000倍時，較大樣量時也可觀察到雜交現(xiàn)象，說明多克隆抗血清可以有效結(jié)合免疫原，效價為1∶8 000 ～1∶12 000(圖5)。

圖4 重組FXRα蛋白表達(dá)(A)與純化(B)的SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE of recombinant FXRα expression(A)and purification(B)

圖5 多克隆抗血清的western blot檢測(A)和效價測定(B)Fig.5 Western Blot of polyclonal anti-sura(A)and its titer determination(B)

3 討論

1995年SEOL等利用酵母雙雜交技術(shù)，以人的核受體RXRα的配體結(jié)合域?yàn)檎T餌篩選小鼠的肝臟cDNA文庫，獲得數(shù)個相互作用蛋白，其中之一被命名為RIP14(RXR-interacting protein 14)。而后，F(xiàn)ORMAN等從大鼠的肝臟cDNA文庫中篩選獲得小鼠RIP14的同源蛋白并發(fā)現(xiàn)法尼醇可以激活大鼠的RIP14，因此大鼠的RIP14被命名為法尼醇X受體(FXR)。最初FXR被認(rèn)為是“孤兒受體”，1999年多個研究組發(fā)現(xiàn)膽汁酸是FXR的內(nèi)源性配體［14-16］。因此，F(xiàn)XR也稱作膽汁酸受體-BAR(bile acid receptor)。體外試驗(yàn)表明膽汁酸在生理濃度下，可以激活FXR。最初，F(xiàn)XR作為膽汁酸受體被廣泛研究，近年來，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FXR不僅在膽汁酸代謝中起樞紐的作用，而且在脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、防止腸道細(xì)菌的過度生長和保持腸道黏膜的完整性、保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展、促進(jìn)肝臟再生等多方面起著重要的作用［17］。

本試驗(yàn)通過提取HepG2細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR得到目的基因，連接到克隆載體PMD-19T上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α里，將所克隆的FXRα構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-28a-FXRα，轉(zhuǎn)化BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組FXRα蛋白在菌體中以包涵體形式表達(dá)。重組蛋白經(jīng)鎳柱純化，透析復(fù)性，免疫兔子，制備了高效價的多克隆抗血清。為進(jìn)一步研究FXRα與其它因子的相互作用奠定基礎(chǔ)。

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