唐曙明，李愛(ài)敏，陳海霞，楊自華

（深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳518020）

根據(jù)乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）全基因核甘酸序列異源性≥8%，或S基因區(qū)核甘酸序列異源性≥4.2%的標(biāo)準(zhǔn)，HBV可分為A～H 8個(gè)基因型[1]。不同HBV基因型具有不同的地理區(qū)域性分布特征，在我國(guó)流行的HBV基因型主要有B、C、D三種，北方地區(qū)以C型為主，約占81.6%，南方地區(qū)則以B、C型為主[2]。不同HBV基因型在致病性和病毒學(xué)特性上存在明顯差異，C、D基因型較B基因型具有更強(qiáng)的致病能力，更容易導(dǎo)致活動(dòng)性肝病和肝細(xì)胞癌[3]。隨著拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）等核苷類抗HBV藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，HBV耐藥的問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重地影響了疾病的轉(zhuǎn)歸。因此，建立簡(jiǎn)便、快速、敏感、高通量的HBV基因分型和耐藥性檢測(cè)方法對(duì)HBV感染的診斷、治療、預(yù)后判斷和流行病學(xué)分析具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 HBV B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株；腺病毒ATCC VR-1079AS/RB（Adenovirus,ADV）、人乳頭瘤病毒ATCC VR-2237（human papillomavirus，HPV）和單純皰疹病毒ATCC VR-1544（herpes simplex virus，HSV）標(biāo)準(zhǔn)株由亞能生物科技有限公司提供，11種標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌）從中國(guó)生物制品檢定所購(gòu)入，187例HBV DNA陽(yáng)性患者（103～109copies/ml）血清樣本來(lái)自本院2012年3月-2012年7月門診和住院患者。

1.1.2 儀器與試劑 ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，電泳儀購(gòu)于北京六一儀器廠，圖像分析系統(tǒng)為BIO-RAD公司GEL DOC 2000，分子雜交箱購(gòu)自韓國(guó)FINE PCR公司，HBV核酸定量檢測(cè)及提取試劑盒購(gòu)于上海科華公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 吸取100μl樣本處理液A于0.5ml離心管中，再加入100μl待檢血清，振蕩混勻，13 000 r/min離心10min，棄上清。加入25μl DNA提取液，震蕩數(shù)秒充分溶解沉淀，2 000 r/min離心30 s。100℃干浴10min，13000 r/min離心10min備用。11種標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)傳代培養(yǎng)后，提取DNA備用。

1.2.2 引物與探針設(shè)計(jì) 用DNAMAN軟件對(duì)GeneBank中HBV的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比對(duì)，于HBV基因保守區(qū)設(shè)計(jì)11條特異性探針?lè)謩e檢測(cè)HBV-B、C、D和常見(jiàn)耐藥突變(rtL180M、rtA181V、rtM204V/I、rtV207I、rtN236T)。另設(shè)1條通用探針作為內(nèi)控點(diǎn)（內(nèi)對(duì)照），以監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的有效性，探針序列見(jiàn)表1。

選擇2對(duì)保守區(qū)片段為擴(kuò)增引物，其中分型引物為：Prime5'：TCGTGTACAGGCGG，Prime3'：ACCAC TGAACAAAT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)510 bp；耐藥引物為：Prime5'：GAGTCTAGACTCGTGGTG，Prime3'：ATTGA TTGGAAAGT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)742 bp。引物的5'用生物素進(jìn)行標(biāo)記，引物和探針由上海生工公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 在25μl反應(yīng)體系中，dNTP混合物的終濃度為0.2 mmol/L，引物的終濃度均為0.4μmol/L，DNA模板20 ng，Taq DNA聚合酶2.5U。置于PCR儀上按下列條件擴(kuò)增：50℃3min，93℃預(yù)變性6 min，然后按93℃30 s→58℃40 s→72℃45 s擴(kuò)增，10個(gè)循環(huán)；93℃30 s→56℃40 s→72℃45 s擴(kuò)增，10個(gè)循環(huán)；93℃30 s→55℃40 s→72℃45 s擴(kuò)增，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 膜芯片制備 尼龍膜浸入5% EDAC 20 min，純水洗膜，晾干。探針稀釋液（5μm/L）點(diǎn)樣于膜條上，晾干后，浸于0.1mol/L NaOH作用3min，純水洗膜，晾干，室溫儲(chǔ)藏備用。

1.2.5 雜交與顯色 將制備好的膜條編號(hào)后放入15ml雜交管中，加入擴(kuò)增產(chǎn)物和6ml雜交緩沖液（2×SSC、0.1%SDS）置于沸水浴10min，放入已預(yù)熱的雜交箱中，57℃雜交1.5 h。取出膜條，移至裝有洗液（0.5×SSC、0.1%SDS）并已預(yù)熱至57℃的50ml管中，于57℃輕搖洗滌15min。取出膜條，按雜交緩沖液：POD=2 000∶1配制孵育液，室溫輕搖孵育30 min，棄去孵育液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗2次，每次5min。用檸檬酸緩沖液（0.1mol/L）室溫洗膜2 min，同時(shí)配制顯色液（19m l0.1mol/L檸檬酸鈉、1 ml 2mg/ml TMB、10μl 3%過(guò)氧化氫H2O2），將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10～15min觀察結(jié)果。

1.2.6 結(jié)果判讀 膜條在內(nèi)控點(diǎn)（CC）位置應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，提示本次雜交、顯色正常工作；其他出現(xiàn)的藍(lán)色斑點(diǎn)表示為相應(yīng)的HBV基因型和耐藥突變類型。

表1 HBV基因分型與耐藥突變探針列表

1.2.7 最低檢出限確定 從187例臨床HBV陽(yáng)性分離株中隨機(jī)抽取38例樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株同步用上海科華HBV核酸定量試劑盒定量，然后進(jìn)行系列稀釋，分別制成104、103和102copies/ml濃度稀釋液，按1.2.1～1.2.5步驟檢測(cè)，以確定新建方法的最低檢出限。

1.2.8 測(cè)序分析 對(duì)1.2.7所述38例臨床樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，以檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增的特異性和膜雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.9 臨床樣本檢測(cè) 用新建方法對(duì)187例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析深圳地區(qū)HBV基因型與耐藥突變分布情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

如圖1所示，對(duì)HBV標(biāo)準(zhǔn)株和187例臨床樣本PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在500 bp和750 bp處可見(jiàn)明顯陽(yáng)性條帶，與預(yù)期片段大小一致。

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 膜芯片雜交結(jié)果

膜條上的探針共兩行，探針位置如表2所示，其中CC為內(nèi)對(duì)照，其余位置分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)探針。由圖2可見(jiàn)，所有雜交膜條在CC位置均出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，其余雜交斑點(diǎn)顯色清晰，提示本次雜交顯色正常。

表2 膜條探針位置示意表

圖2 部分HBV臨床樣本與標(biāo)準(zhǔn)株反向斑點(diǎn)雜交結(jié)果圖

2.3 DNA測(cè)序結(jié)果

對(duì)38例臨床樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行測(cè)序分析，其結(jié)果與膜芯片結(jié)果完全一致（圖3）。

2.4 特異性與最低檢出限確定

將ADV、HPV、HSV標(biāo)準(zhǔn)株和11種標(biāo)準(zhǔn)菌株用新建方法檢測(cè)，結(jié)果在膜芯片上未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)斑點(diǎn)。HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床株分別制成104、103和102copies/ml濃度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各株濃度在103copies/ml時(shí)檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，當(dāng)菌液稀釋至102copies/ml時(shí)，有8例陽(yáng)性顯色已經(jīng)明顯變?nèi)酰?0例臨床株未見(jiàn)陽(yáng)性顯色。

2.5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

在187例HBV陽(yáng)性臨床樣本中檢出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；另有1例不能分型，未測(cè)出D型。在187例臨床樣本中共檢出耐藥突變49例，占26.2%。在49例耐藥突變中，20例為rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例為rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例為rtM204I，占16.3%；4例為rtA181V，占8.2%；2例為rtN236T，占4.1%，1例 為rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例為rtV207I，占2.0%。在49例耐藥突變中，有32例為HBV-C，占65.3%；17例為HBV-B，占34.7%。

圖3 部分HBV臨床樣本與標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖

3 討論

HBV為一不完全環(huán)狀雙鏈DNA分子，基因組長(zhǎng)約3 200 bp，含前-S/S區(qū)、前-C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)共4個(gè)主要的開(kāi)放讀碼框（ORF）。HBV復(fù)制的顯著特征是存在一個(gè)有逆轉(zhuǎn)錄酶參與的、以mRNA為中間體的DNA-RNA-DNA過(guò)程。由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，故在HBV復(fù)制過(guò)程中核苷酸錯(cuò)配率高，基因突變頻繁發(fā)生[4]。研究顯示，S區(qū)基因序列既含相對(duì)穩(wěn)定的序列保守區(qū)，又含相對(duì)多態(tài)的序列變異區(qū)，適用于HBV基因分型[5]，而所有核苷（酸）類似物耐藥突變位點(diǎn)都位于HBV DNA聚合酶基因區(qū)（逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)），故耐藥性檢測(cè)探針多依據(jù)此區(qū)序列設(shè)計(jì)。本研究根據(jù)HBV S區(qū)基因多重比對(duì)結(jié)果，于保守區(qū)設(shè)計(jì)1條通用探針作為內(nèi)對(duì)照，另設(shè)3條特異性探針?lè)謩e檢測(cè)HBV基因型B～D。根據(jù)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因多重比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了rt180L、rt180M、rt204M、rt204V、rt204I、rt181A、rt181V、rt207M、rt207V、rt207I、rt236N和rt236T 5個(gè)位點(diǎn)共12條探針，基本上涵蓋了4種抗HBV核苷（酸）類似物的常見(jiàn)耐藥突變。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增，電泳出現(xiàn)預(yù)期條帶，表明擴(kuò)增成功。將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例HBV臨床樣本的PCR產(chǎn)物與膜條雜交，結(jié)果在內(nèi)控制（CC）位置均有明顯雜交信號(hào)，表明雜交成功，擴(kuò)增片段為目的基因片段。在膜芯片相應(yīng)探針位置出現(xiàn)的陽(yáng)性顯色背景清晰，無(wú)交叉反應(yīng)和其他非特異性反應(yīng)。將ADV、HPV、HSV和11種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA擴(kuò)增后雜交，結(jié)果均為陰性，其特異性達(dá)到了100%。為進(jìn)一步驗(yàn)證膜芯片對(duì)HBV分型和耐藥檢測(cè)的準(zhǔn)確性,本研究將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將雜交結(jié)果與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，膜芯片結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，準(zhǔn)確性達(dá)到100%。為確定方法的檢測(cè)靈敏度，本研究將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床樣本用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行載量確認(rèn)后，分別制成104、103和102copies/ml濃度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)最低檢出限達(dá)103copies/ml，表明該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，從而肯定了其在分型和耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

目前國(guó)際上已統(tǒng)一了HBV耐藥位點(diǎn)的定位命名，即從逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的上游第一個(gè)氨基酸起，分別為rtl～rt344[6]。研究表明，拉米夫定（LAM）最常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)閞tM 204I/V±rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨(dú)出現(xiàn)，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為24%、38%、49%、67%與70%[7]。阿德福韋酯（ADV） 常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)閞tN236T與rtA181V/T變異，兩個(gè)位點(diǎn)變異可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0%、3%、11%、18%與29%[8]。恩替卡韋（ETV）常見(jiàn)的耐藥突變是在rtM204V+rtL180M變異基礎(chǔ)上，再聯(lián)合aT184、rtS202或aM250三個(gè)位點(diǎn)中至少一個(gè)位點(diǎn)突變，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0.2%、0.5%、1.2%、1.2%與1.2%[9]。替比夫定（LdT）常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)閞tM204I，其1～2年累積耐藥發(fā)生率分別為4%與22%[10]。

在對(duì)187例HBV陽(yáng)性臨床樣本檢測(cè)結(jié)果中，檢出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；未測(cè)出D型；另有1例不能分型，分析可能為HBV-B、C、D之外的其他基因型。187例HBV陽(yáng)性臨床樣本共檢出耐藥突變49例，占26.2%。在49例耐藥突變中，20例為rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例為rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例為rtM204I，占16.3%；4例為rtA181V，占8.2%；2例為rtN236T，占4.1%，1例為rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例為rtV207I，占2.0%。在49例耐藥突變中，有32例為HBV-C，占65.3%；17例為HBV-B，占34.7%。上述結(jié)果與以往的研究基本相符[11-12]。

目前常用于HBV基因型與耐藥突變的分子檢測(cè)方法一般都基于PCR、核酸分子雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析和DNA測(cè)序等原理，在已報(bào)道的方法中，或因操作步驟復(fù)雜、檢測(cè)位點(diǎn)單一而不適應(yīng)現(xiàn)代大規(guī)模檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查的要求，或因價(jià)格昂貴而難以在臨床推廣應(yīng)用。本研究以多重PCR和反向線性雜交為基礎(chǔ)，建立了膜芯片方法來(lái)同步檢測(cè)HBV的基因型和耐藥性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本方法簡(jiǎn)便、快捷，具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可大大降低臨床HBV基因分型和耐藥性檢測(cè)的成本、縮短檢測(cè)周期，為研究HBV的流行病學(xué)規(guī)律、快速制訂最佳治療方案、降低耐藥毒株在人群中的播散從而最終控制HBV提供了新的技術(shù)平臺(tái)，適合在臨床推廣使用。

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