嚴(yán) 娟， 蔡志翔， 馬瑞娟， 張斌斌， 沈志軍， 郭紹雷， 俞明亮

( 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

果品中含多種糖分，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多為異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)差異性小，采用常規(guī)方法對(duì)其分離鑒定比較困難。加之單糖既無(wú)強(qiáng)的紫外吸收，又無(wú)熒光基團(tuán)，而且在通常情況下為電中性，植物組織中糖檢測(cè)廣泛應(yīng)用的高效液相色譜法( HPLC) 通常需要進(jìn)行衍生反應(yīng)，使之具有強(qiáng)紫外吸收、熒光特性或其他一些可測(cè)定的物理化學(xué)性質(zhì)，再使用選擇性檢測(cè)器如紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等進(jìn)行檢測(cè)［1-5］，但這樣處理步驟復(fù)雜，可能會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定基團(tuán)的分解，造成測(cè)定結(jié)果的偏差［6］。目前常采用液相色譜搭載通用型檢測(cè)器，如示差折光檢測(cè)器( HPLC-RID) 測(cè)定蔬菜果品中糖組分［7-10］，樣品不需衍生化處理，可以直接測(cè)得糖分，但相對(duì)于紫外檢測(cè)器而言，示差折光檢測(cè)器( RID) 靈敏度不高，且易受外界環(huán)境干擾，對(duì)溫度變化非常敏感，難以平衡，流動(dòng)相的波動(dòng)、洗脫液比的變化等都會(huì)明顯影響折射率。

可變波長(zhǎng)檢測(cè)器( VWD) 是紫外檢測(cè)器的一種，幾乎所有的HPLC 都配有這種檢測(cè)器。VWD 選擇性高，對(duì)溫度、流動(dòng)相的波動(dòng)和組成的變化不甚敏感。液相色譜搭載可變波長(zhǎng)檢測(cè)器( HPLC-VWD)具有良好的光學(xué)性能，廣泛用于對(duì)大多數(shù)有紫外吸收的化合物的檢測(cè)［11-14］。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍認(rèn)為HPLC-VWD 不適用于糖類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，這是因?yàn)樘穷?lèi)特別是葡萄糖等物質(zhì)吸光度極其微弱，需要選用很低的波長(zhǎng)區(qū)間進(jìn)行檢測(cè)，而常用測(cè)定糖類(lèi)的色譜條件選擇的流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)都較高，會(huì)產(chǎn)生背景吸收。有文獻(xiàn)總結(jié)稱(chēng)選擇性檢測(cè)器無(wú)法對(duì)糖類(lèi)組分進(jìn)行檢測(cè)［15-16］，而VWD 就是典型的選擇性檢測(cè)器。也就是說(shuō)，一直存在VWD 不適用于檢測(cè)糖類(lèi)物質(zhì)的技術(shù)偏見(jiàn)。謝志剛等［17］利用HPLCVWD 直接測(cè)定硫酸氨基葡萄糖氯化鉀膠囊中氨基葡萄糖的含量。氨基葡萄糖是一種天然的氨基單糖，是葡萄糖中的一個(gè)羥基被氨基取代，多了一個(gè)氮元素，是直鏈伯胺，具有胺的性質(zhì)［18］，因此謝志剛等［17］報(bào)道的采用氨基柱，無(wú)需衍生化直接對(duì)氨基葡萄糖進(jìn)行測(cè)定的HPLC-VWD 法，對(duì)植物組織中廣泛存在的，由碳、氫、氧三元素構(gòu)成的糖類(lèi)物質(zhì)，如蔗糖、葡萄糖、果糖等的檢測(cè)不具有通用性?？傊?，目前為止，尚無(wú)HPLC-VWD 用于直接檢測(cè)果品以及其他植物組織中各種糖類(lèi)的記載。本試驗(yàn)擬建立一種無(wú)需衍生即可直接測(cè)定果品中糖組分的HPLCVWD 法，為測(cè)定果品和其他植物組織中糖組分含量提供一種簡(jiǎn)單有效的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)果品包括紫金紅1 號(hào)桃和5 個(gè)果肉中糖類(lèi)含量高低較典型的桃品種( 參照沈志軍等［19］的結(jié)果，5 個(gè)桃品種分別為低蔗糖低果糖的烏雞黑肉桃、高蔗糖的日本86、低葡萄糖的霞暉5 號(hào)，高葡萄糖高果糖高山梨醇的黑油桃、低山梨醇的金山早紅) ，均取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)南京桃資源圃，按照常規(guī)栽培方法種植，統(tǒng)一田間管理。另參照文獻(xiàn)［10］、［20］、［21］、［22］選擇其他4 種水果作為驗(yàn)證，包括含微量蔗糖、高葡萄糖高果糖、無(wú)山梨醇的葡萄巨玫瑰、以積累果糖為主的蘋(píng)果紅富士、以積累蔗糖為主的粉蕉廣粉1 號(hào)和高山梨醇的梨豐水作為試驗(yàn)材料進(jìn)行糖組分測(cè)定。果實(shí)洗凈后用吸水紙吸干，迅速刨皮，果肉用液氮速凍后置于－20 ℃冰箱備用。

1.2 試劑與設(shè)備

本試驗(yàn)選擇果品中常見(jiàn)的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇共4 種糖類(lèi)為標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自Sigma 公司;乙醇試劑為分析純。

Agilent 高效液相色譜系統(tǒng): 1100 系列，CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm× 300.0 mm，10 μm) 柱，VWD 和RID 2 種檢測(cè)器。真空濃縮儀。

1.3 HPLC-VWD 法測(cè)定水果中糖組分

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品1.6 g，用超純水溶解定容，制得濃度為160 g/L的各標(biāo)準(zhǔn)品母液;并用超純水逐級(jí)減倍稀釋?zhuān)频酶骷?jí)別單標(biāo)溶液和混標(biāo)溶液備用。

1.3.2 色譜條件 由于考慮到糖的吸光度很微弱，用VWD 檢測(cè)需要選很低的波長(zhǎng)區(qū)間，而所用溶劑和流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)也必須要低。本試驗(yàn)采用色譜柱CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm× 300.0 mm，10 μm) ，流動(dòng)相為超純水，其截止波長(zhǎng)只有190 nm，樣品溶劑也相應(yīng)用超純水，完全符合VWD 檢測(cè)糖時(shí)要求波長(zhǎng)低的首要條件; 同時(shí)對(duì)波長(zhǎng)190 nm、195 nm、和200 nm 進(jìn)行洗脫篩選; 流速和柱溫均按照適于該色譜柱的最佳條件，即流速0.5 ml/min，柱溫80 ℃;考慮到色譜柱的承載能力和檢測(cè)器的靈敏度，對(duì)進(jìn)樣量大小作了5 μl、10 μl 和15μl 的篩選。在對(duì)VWD 和RID 2 種檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，色譜條件保持一致。

1.3.3 樣品的制備 稱(chēng)取果品果肉勻漿1.0 g，加入7 ml 80%乙醇( 體積比) ，室溫提取48 h，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10.0 ml;吸取2.0 ml 提取液濃縮至干，再用0.5 ml 超純水溶解，經(jīng)0.22 μm 水系濾頭過(guò)濾后進(jìn)色譜柱。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制及方法評(píng)價(jià) 在確定的色譜條件下，分別將不同濃度的糖混標(biāo)溶液進(jìn)樣分析，所用混標(biāo)濃度梯度為40.000 g/L、20.000 g/L、10.000 g/L、5.000 g/L、2.500 g/L、1.250 g/L、0.625 g/L，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

對(duì)方法的線(xiàn)性范圍、最低檢出限、回收率和精密度進(jìn)行測(cè)定［14］。移取各糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 ml 分別加入0.5 g 紫金紅1 號(hào)桃果肉勻漿樣品中，按照上述方法進(jìn)行提取和HPLC-VWD 測(cè)定，重復(fù)6 次，根據(jù)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。取各級(jí)別濃度的糖單標(biāo)溶液，進(jìn)樣測(cè)定，得到最低檢出限( 以信噪比S/N=3 時(shí)的質(zhì)量濃度為最低檢出限) 。

1.4 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測(cè)定5 個(gè)桃品種糖含量

將制備好的桃樣品按確立的色譜條件分別用HPLC-VWD 和HPLC-RID 進(jìn)行測(cè)定，利用SPSS 軟件配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)，比較2 種檢測(cè)器測(cè)定的糖含量的差異。

1.5 HPLC-VWD 法測(cè)定其他水果中糖含量

將制備好的果品樣品按確立的HPLC-VWD 檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-VWD 測(cè)定方法的建立

使用HPLC-VWD 方法測(cè)定糖，最關(guān)鍵的是波長(zhǎng)的選擇。本試驗(yàn)對(duì)190 nm、195 nm、200 nm 3 個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行洗脫篩選，發(fā)現(xiàn)190 nm 分離糖組分的效果最好。同時(shí)進(jìn)樣量的大小對(duì)分離效果并沒(méi)有太大影響，考慮到色譜柱的承載能力，將進(jìn)樣量定為5 μl。因此確定了HPLC-VWD 檢測(cè)水果中糖組分的色譜條件為: 流動(dòng)相超純水，進(jìn)樣量5 μl，流速0.5 ml/min，溫度80 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)190 nm。在此條件下各糖類(lèi)物質(zhì)分離效果好，色譜峰正常穩(wěn)定，得到了4種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖( 圖1) 和紫金紅1 號(hào)桃樣品圖( 圖2) ，30 min 即可完成樣品的檢測(cè)。

圖1 4 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC-VWD 圖Fig.1 Chromatogram of four kinds of sugars in a standard mixture by HPLC-VWD

圖2 紫金紅1 號(hào)桃果肉樣品中糖的HPLC-VWD 圖Fig.2 Chromatogram of sugars extracted from Zijinhong 1 peach flesh by HPLC-VWD

2.2 HPLC-VWD 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、最低檢出限和回收率見(jiàn)表1。在相應(yīng)的線(xiàn)性范圍內(nèi)，各種糖線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999 9以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.53% ～2.71%，回收率為92% ～103%，精密度較高，結(jié)果準(zhǔn)確。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程和方法評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Linear equation between peak area and sugar content detected by HPLC-VWD and evaluation of the method

2.3 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測(cè)定5 個(gè)桃品種中糖含量結(jié)果的比較

5 個(gè)桃品種樣品分別用HPLC-VWD 和HPLCRID 法測(cè)定的糖組分含量結(jié)果見(jiàn)表2。2 種方法對(duì)各種糖含量高低典型的桃品種的4 種糖測(cè)定結(jié)果都能反應(yīng)出各品種糖含量的特點(diǎn)，即烏雞黑肉桃明顯表現(xiàn)為低蔗糖低果糖，日本86 為高蔗糖，霞暉5 號(hào)為低葡萄糖，黑油桃為高葡萄糖高果糖高山梨醇，金山早紅為低山梨醇。5 個(gè)品種每種糖的HPLC-VWD 和HPLC-RID 法所測(cè)得結(jié)果差異不顯著( P ＞0.05) 。

表2 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測(cè)定的不同桃品種糖組分含量Table 2 Sugars contents in different peach cultivars detected by HPLC-VWD and HPLC-RID

2.4 HPLC-VWD 法測(cè)定其他果品中糖含量

葡萄品種巨玫瑰、蘋(píng)果品種紅富士、粉蕉品種廣粉1 號(hào)和梨品種豐水4 種果品樣品HPLC-VWD 檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖3，各糖組分含量見(jiàn)表3。各果品中糖種類(lèi)和含量水平與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，表現(xiàn)為在葡萄中未檢出山梨醇，蘋(píng)果中果糖含量最高，香蕉中蔗糖含量最高，梨中含有豐富的山梨醇［10，20-22］。

圖3 4 種水果果肉樣品中糖含量的HPLC-VWD 圖Fig.3 Chromatogram of sugar contents in the flesh of four fruits by HPLC-VWD

表3 4 種水果果肉樣品中糖含量Table 3 Sugar contents in the flesh of four fruits

3 討論

糖類(lèi)是水果中重要的品質(zhì)指標(biāo)，對(duì)其檢測(cè)方法需要沿著高靈敏度、快速測(cè)定及高選擇性的方向發(fā)展。由于可用于糖類(lèi)物質(zhì)直接檢測(cè)的RID 本身存在不穩(wěn)定和靈敏度低的問(wèn)題，而且間接測(cè)定的衍生化方法程序繁雜、反應(yīng)條件較苛刻、反應(yīng)速度較慢［6］，因此在尋找反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快的衍生化方法的同時(shí)［18］，建立一種高效液相色譜搭載靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性高的紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)糖組分的方法將具有較大的研究意義。

因?yàn)樘穷?lèi)吸光度弱，需要很低的檢測(cè)波長(zhǎng)區(qū)間，要實(shí)現(xiàn)HPLC-VWD 直接檢測(cè)糖類(lèi)物質(zhì)，最重要的問(wèn)題是解決流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)的問(wèn)題，才能防止出現(xiàn)背景吸收。衍生化間接測(cè)定的HPLC 法大多采用C18和氨基色譜柱等，流動(dòng)相多為鹽類(lèi)緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng)較高，造成實(shí)踐中一直無(wú)法利用VWD 對(duì)糖類(lèi)進(jìn)行直接檢測(cè)［3-5］。本研究選擇的CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm×300.0 mm，10 μm) 柱［23］，流動(dòng)相為超純水，其截止波長(zhǎng)為190 nm，通過(guò)試驗(yàn)篩選，在該檢測(cè)波長(zhǎng)下，果品中各糖類(lèi)物質(zhì)能很穩(wěn)定地分離，在相應(yīng)的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53% ～2.71%，回收率為92% ～103%;另外，為了避免葡萄糖等組分出現(xiàn)假波峰，定量缺乏可靠性的現(xiàn)象出現(xiàn)，特設(shè)計(jì)了不同桃品種糖組分HPLC-VWD 和HPLC-RID 2 種檢測(cè)方法的比較試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種方法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明HPLC-VWD 可以真實(shí)穩(wěn)定地對(duì)糖類(lèi)進(jìn)行分離和檢測(cè)。

另外需要指出的是:①由于VWD 檢測(cè)器和RID檢測(cè)器的靈敏度在實(shí)際應(yīng)用中基本接近，在本研究中未列出2 種方法的檢出限比較數(shù)據(jù); ②針對(duì)目前一些實(shí)驗(yàn)室常搭載DAD( 二極管陣列) 檢測(cè)器進(jìn)行液相測(cè)定，因此可考慮HPLC-DAD 是否也可適用于對(duì)果品糖組分的測(cè)定;③本研究所得HPLC-VWD 方法可以對(duì)果品果肉中糖組分進(jìn)行分離檢測(cè)，那么是否適用于其他植物組織，如花、葉、枝等糖組分的檢測(cè)還有待研究，因?yàn)楸痉椒ǖ臋z測(cè)波長(zhǎng)為190 nm，可能會(huì)受一些組織中含量較高的、在該波段有紫外吸收的物質(zhì)( 如酚類(lèi)等) 的影響，無(wú)法準(zhǔn)確定性定量，因此在實(shí)際應(yīng)用中，可考慮在上柱分析前結(jié)合大孔樹(shù)脂等材料分離除去相應(yīng)的干擾物質(zhì)。

本研究利用HPLC-VWD 法，采用CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm×300.0 mm，10 μm) 柱，以超純水為流動(dòng)相沖洗，流速0.5 ml/min，溫度80℃，檢測(cè)波長(zhǎng)190 nm，適于果品中糖組分的直接測(cè)定。該法無(wú)需衍生反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，精確可靠，打破了一直存在的HPLC-VWD 無(wú)法直接測(cè)定糖類(lèi)物質(zhì)的技術(shù)偏見(jiàn)，可為利用HPLC 測(cè)定水果和其他植物組織中糖組分含量提供一種新的檢測(cè)方法。

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