郭 亮 王谷洪 周 齊 劉旭海 王桂華

（1.深圳市瑞升華科技股份有限公司，廣東 深圳518000；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌330000）

0 引言

黃酮類化合物在自然界中普遍存在，呈現(xiàn)弱酸性。在雙子葉植物的葉、根、莖以及果實(shí)中大量存在。而山楂葉所含的活性組分大多為黃酮苷，它們的極性不同，可根據(jù)相似相溶原理，用水、丙醇、正丁醇等提取。黃酮類化合物能使心肌的耗氧量減少，在預(yù)防動(dòng)脈硬化方面有良好的作用；同時(shí)黃酮化合物還能延緩人體衰老過程，增強(qiáng)人體免疫力，對(duì)人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有良好的調(diào)節(jié)作用；而且黃酮還具有防癌的作用，對(duì)一些冠狀動(dòng)脈心臟疾病相關(guān)的癥狀有一定的預(yù)防作用。因此這些化合物能夠廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、保健食品添加劑和殺蟲劑等領(lǐng)域，于是在國(guó)內(nèi)外越來越成為人們研究的熱點(diǎn)。

PEG 是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的簡(jiǎn)稱，無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，并與許多有機(jī)物組分有良好的相溶性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器、試劑與材料

紫外分光光度計(jì)（龍尼柯有限公司）、離心機(jī)（北京離心機(jī)廠）、恒溫水浴鍋（上海儀器有限公司）、干燥箱（江蘇曙峰企業(yè)）、分析天平（萊陽化工有限公司）。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080－200707）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，山楂購(gòu)自國(guó)藥控股福建有限公司中藥部。

所有試劑均為分析純。

1.2 山楂粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取山楂碎末5g，放到燒杯中，向燒杯中加入60%乙醇120mL，混合5min，然后將溶液轉(zhuǎn)移至250mL 容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至刻度，搖勻，充分混合，靜置4h后，減壓過濾得到暗紅色的山楂粗提液。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用分析天平稱取5 mg 蘆丁，加60%乙醇溶解，定容到100mL，得到50μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取6只容量瓶，標(biāo)號(hào)1、2、3、4、5、6號(hào)，用移液管移取0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加入到1 號(hào)容量瓶中，然后加入5% NaNO2溶液0.7mL混合均勻，5min后再加入10%Al（NO3）3溶液0.7mL，混合均勻，過5 min 之后，向混合液中加入5% NaOH 溶液0.7mL，然后用30%乙醇定容，混合均勻。分別向2 號(hào)加入1mL、3號(hào)加入2mL、4號(hào)加入3mL、5號(hào)加入4mL、6號(hào)加入5mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，其他步驟與前面一致，靜置10 min左右在512nm 處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，以1號(hào)容量瓶中的溶液作為空白對(duì)照，分別測(cè)量各組的吸光度，把蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，各組得到的吸光度A 作為縱坐標(biāo)，做出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝18.611C＋0.007 7，r＝0.999 1，蘆丁濃度在1～6μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.4 雙水相體系的配制

將一定量的聚乙二醇、硫酸銨、3 mL 粗提液，加入一部分蒸餾水，用0.1mol/L的NaOH 和0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH，使雙水相系統(tǒng)的總質(zhì)量為10g。搖勻使兩相充分混合，在離心機(jī)中離心，使之快速分相，5min后取出。用膠頭滴管分別吸取上、下相溶液進(jìn)行分析，分別測(cè)定上、下相體積，雙水相中山楂總黃酮的含量。

1.5 山楂中總黃酮含量的測(cè)定

取6個(gè)試管，標(biāo)號(hào)1、2、3、4、5、6號(hào)，向2號(hào)管中加入對(duì)照液1.0mL、3號(hào)管中加入2.0mL、4號(hào)管中加入3.0mL、5號(hào)管中加入4.0mL、6號(hào)管中加入5.0 mL，分別加入50%乙醇使成5mL；精密加入5% NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L NaOH 溶液4mL；用50%乙醇加到10mL處，混合均勻。

向1 號(hào)管中加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L NaOH 溶液4mL；用50%乙醇定容到10mL處，混合均勻，作為對(duì)照溶液，在512nm 波長(zhǎng)處測(cè)定待測(cè)液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)方程，分析計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖

將用濁點(diǎn)法計(jì)算出來的PEG800、1000、2000 的質(zhì)量濃度和（NH4）2SO4質(zhì)量濃度在一個(gè)坐標(biāo)系中作出相圖，得到PEG的平均分子量不同，相圖中雙接線位置與形狀也不同，PEG 分子量增大，曲線越接近坐標(biāo)軸。

2.2 PEG 平均分子量對(duì)雙水相體系的影響

以相圖為依據(jù)，選擇質(zhì)量濃度20%的PEG800和質(zhì)量濃度20%的（NH4）2SO4混合，分析計(jì)算山楂中黃酮的分配系數(shù)K 和萃取率，然后繼續(xù)改變PEG 的分子量，使硫酸銨的質(zhì)量濃度不變，分別測(cè)定在PEG1000和PEG2000的情況下黃酮的萃取結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，黃酮在雙水相中的分配系數(shù)和萃取率和PEG 的變化成反比，這可能是因?yàn)楫?dāng)PEG 分子量變大時(shí)，上、下兩相界面間的張力變大，從而影響了傳質(zhì)效率，導(dǎo)致分配系數(shù)和萃取率減小。PEG 平均分子量越低，水溶性越好，K 值和萃取率在PEG800 時(shí)達(dá)到最大。根據(jù)相似相溶原理，山楂中可能含親水性的黃酮類化合物較多，所意選擇PEG800較好。

表1 PEG 平均分子量對(duì)雙水相體系的影響

考慮成相的條件，由于靠近臨界點(diǎn)位置的系統(tǒng)不容易形成兩相系統(tǒng)，而距離臨界點(diǎn)位置較遠(yuǎn)的系統(tǒng)，PEG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較大，黏度比較大，兩相分離的時(shí)間比較長(zhǎng)，因此選擇PEG 和（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要適中，既要使雙水相系統(tǒng)的形成時(shí)間盡可能縮短，同時(shí)又不會(huì)有晶體析出。

2.3 PEG800的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG800 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的（NH4）2SO4分別組成雙水相體系，分析山楂中總黃酮的分配系數(shù)和萃取率（表2）。

表2 PEG800的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

從表2可以看出，隨著PEG800質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，相比R、分配系數(shù)K 和萃取率Y 也在升高，在PEG800 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，達(dá)到最大，所以PEG800的合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%。

2.4 （NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

選擇不同質(zhì)量濃度的（NH4）2SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG800組成雙水相體系，分別分析計(jì)算山楂中黃酮的分配系數(shù)K 和萃取率Y（表3）。

表3 （NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

從表3中可以看出，（NH4）2SO4質(zhì)量濃度越大，相比R 值越小，制作相圖可以得到萃取率Y 和分配系數(shù)隨（NH4）2SO4質(zhì)量濃度的變化不一致，分配系數(shù)先增大，達(dá)到一個(gè)極值點(diǎn)然后下降，而黃酮的萃取率卻一直在減小。因而選擇質(zhì)量濃度為12%的（NH4）2SO4。

2.5 影響山楂中黃酮萃取的因素

2.5.1 pH 的影響

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG800 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的（NH4）2SO4作為雙水相體系，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值，得到結(jié)論在pH＝9時(shí)，分配系數(shù)和萃取率最大，為最佳pH。

2.5.2 樣品加入量的影響

在25%PEG800和12%（NH4）2SO4、pH＝9時(shí)，加入不同體積的粗提液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出，當(dāng)粗體液的體積超過3mL時(shí)分配系數(shù)K 和萃取率Y 都下降，萃取率在3 mL 時(shí)達(dá)到最高，因此確定粗提液體積最佳值為3mL。

3 結(jié)語

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，萃取分離山楂中總黃酮的最佳雙水相體系條件是25%PEG800和12%（NH4）2SO4，樣品加入量3mL，pH＝9。在此條件下，黃酮的萃取率能達(dá)到95%以上。因此，實(shí)驗(yàn)中采用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系萃取分離山楂中總黃酮的方法是可行的，可以作為黃酮類化合物萃取分離的一種有效方法。