摘 要 采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對銀杏雌雄種子蛋白進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雌雄種子的胚乳蛋白條帶差異明顯，雌雄種子的胚體蛋白幾乎沒有差異；雄種子胚乳蛋白中發(fā)現(xiàn)2條雌種子胚乳蛋白沒有的譜帶。這可以為銀杏雌雄樹種子的甄別提供指導。

關(guān)鍵詞 銀杏；雌雄種子；蛋白質(zhì)；SDS-PAGE電泳

中圖分類號：Q944 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）13-047-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20150605.1853.010.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015/6/5 18：53：01

銀杏（Ginkgo biloba L.）為裸子植物門銀杏綱銀杏屬植物，是我國特有的古老珍貴樹種之一，素有國家“活化石”之稱，是國家二級保護植物[1]。從銀杏樹的外觀可以辨別雌雄銀杏樹，從苗期、葉片、花和花芽、樹冠、樹枝和物候期方面也可以區(qū)分[2]。但從分子方面辨別雌雄種子的研究甚少。銀杏種實去掉肉質(zhì)外種皮后的種核部分俗稱白果。雌樹種子核果狀，果核圓，有二棱，果核頭尖；有三棱的種子多發(fā)育為雄樹[3]。所以，從種核外觀上可以區(qū)分雌雄種子（圖1）。

銀杏種子內(nèi)部由胚體和胚乳組成（圖2），白果富含蛋白質(zhì)、淀粉、糖類和脂肪等物質(zhì)[4]。白果中蛋白質(zhì)含量達到80.36%，而糖類等其他物質(zhì)含量相對較少[5]。銀杏種子中蛋白有水溶性、醇溶性、鹽溶性、堿溶性之分，而水溶性含量相對較高，其他含量相對較低；同時，儲藏種子與萌動種子的蛋白質(zhì)含量接近，但萌動種子可溶性蛋白質(zhì)的含量比儲藏種子高[6]。

本實驗采用當年種子為材料，以雙蒸水為溶劑，添加蛋白提取劑，并對雌雄果實的胚體和胚乳的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，從蛋白方面分析銀杏雌雄果蛋白條帶的差異，為銀杏雌雄樹種子的甄別提供指導。

1材料與方法

1.1材料

銀杏雌果和雄果：購買當年銀杏果實種子及采摘蘇州大學公教樓前銀杏樹果實。

1.2主要試劑

蛋白質(zhì)樣品緩沖液，過硫氨酸，四甲基乙二胺。

電泳試劑：分離膠緩沖液與濃縮膠緩沖液，電泳緩沖液（Tris-甘氨酸系統(tǒng)）。

染色試劑：考馬斯亮藍G-250。

脫色試劑：冰乙醇，甲醇，雙蒸水。

1.3方法

1.3.1 材料采集

10月份從銀杏樹上采摘果實，用堿液去皮法除掉外種皮，置干燥箱干燥后挑選出雌雄種子；同時，購買一批銀杏雌雄種子。

1.3.2 雌雄銀杏種子胚體和胚乳蛋白樣品的制備

（1）研磨：分別稱取銀杏雌雄種子胚體和胚乳各0.1 g，放入研缽中，加液氮研磨。

（2）水浴：將稱好的樣品裝入離心管中，加入1 mL蛋白提取液，在60℃的條件下水浴30 min，取出冷卻靜置。

（3）離心：在10000 r/min的條件下離心8 min。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考雌雄異株植物銀杏特異蛋白初步分析文獻，采用單向SDS-PAGE電泳法。首先按照材料比例配制分離膠，用移液管灌注分離膠；待分離膠凝固后，作出記號，再加入濃縮膠，插下1.5 cm寬的梳子；在灌膠時要注意膠面的平整，使膠體結(jié)構(gòu)整齊，留有適度長度的濃縮膠，過少過多都會影響蛋白條帶的直順和清晰度。插梳子時切忌有氣泡。待膠體凝固后加入樣品，分別加入雌果胚體蛋白、雌果胚乳蛋白、雄果胚體蛋白、雄果胚乳蛋白，加入電泳液，內(nèi)部加滿、外部半滿即可。電泳時電泳液的純度會影響電泳效果，如果電泳液已經(jīng)使用多次污染嚴重或是放置已久，需及時更換。接上電泳儀，濃縮膠電壓80～90 V，分離膠電壓120～130 V，指示劑遷移至距下沿約1.5 cm時停止電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，用染色液染色。

1.3.4 染色

凝膠用染色液染色大約15 min，倒去染色液用脫色液脫色，在搖床上搖晃以加強脫色效果。應(yīng)注意及時更新脫色液，保證脫色效果。脫色后用蒸餾水漂洗，然后拍照。

2結(jié)果與分析

2.1銀杏雌雄種子胚乳蛋白的分析

圖3顯示，從左向右第1、2條蛋白條帶是胚乳蛋白條帶，第1條條帶是雌種子胚乳蛋白，第2條條帶是雄種子胚乳蛋白，從圖中可知雌雄胚乳間蛋白條帶有明顯差異。雄胚乳比雌胚乳多了2條蛋白條帶，如圖中箭頭所示。

2.2銀杏雌雄種子胚體蛋白的分析

圖3顯示，從左向右第3、4條蛋白條帶是胚體蛋白條帶，第3條條帶是雌種子胚體蛋白，第4條條帶是雄種子胚體蛋白，從圖可知雌雄種子胚體和胚乳之間的蛋白沒有明顯差異。

3討論

3.1銀杏種子材料適宜的準備時期

銀杏胚珠于4月初開始發(fā)生，至4月份大部分胚珠產(chǎn)生傳粉滴，此時為傳粉受粉的最佳時期[7]。銀杏的傳粉與受精作用相距近5個月，至8月30日左右，種皮和胚乳的發(fā)育已近成熟，這時才進入受精作用的高峰期，受精卵形成并發(fā)育為胚[8]。所以，確定9月底10月份為合適的采摘時期。

3.2蛋白條帶差異說明

基因決定蛋白質(zhì)的生成，雌雄銀杏種子胚乳間的蛋白差異條帶說明了雌雄種子基因間的差異，差異基因決定雌雄種子胚乳蛋白的差異，可以為從蛋白水平辨別銀杏的雌雄提供參考依據(jù)。

3.3凝膠比例

不同的凝膠比例可以遷移出不同長度的蛋白條帶，對于聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度越大分離蛋白的分子量就越小。分離膠濃度太大，分子量大的蛋白質(zhì)分不開，太小則分子量小的蛋白質(zhì)難以分開[9]。從圖3可知在分離膠的最上方有一些條帶還未完全遷移開，可以通過這些蛋白譜帶上的條帶所代表的蛋白長度大小來選擇適合濃度比例的凝膠，以探知是否還有其他差異蛋白條帶。也可改進方法，采用雙向電泳技術(shù)遷移出更多的蛋白條帶。

參考文獻：

[1]黃文，謝筆鈞.白果蛋白質(zhì)的分離、純化、理化特性及其抗氧化性活性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（10）：1537-1543.

[2] 胡一民.雌雄銀杏巧區(qū)別[J].安徽農(nóng)業(yè)，1996，（10）：11.

[3]梁立興.中國銀杏[M].濟南：山東科學技術(shù)出版社，1988.

[4]林睦就，張云躍.我國銀杏遺傳變異研究之二：種仁營養(yǎng)成分和無機元素含量的變異[J].林業(yè)科學，2002，38（2）：157-161.

[5]孫小斐，喬玉輝.白果蛋白的提取分離及其等電點的測定[J].食品工業(yè)，2012，33（9）：156-157.

[6]梁紅，徐斌，潘偉民，等.銀杏種子和葉的蛋白分析[J].植物資源與環(huán)境學報，2000，9（4）：5-8.

[7]王莉，王水平，汪瓊，等.銀杏胚珠發(fā)育進程的解剖學研究[J].西北植物學報，2007，27（7）：1349-1356.

[8]于新，馮彤，龐杰.不同時期銀杏種子成分及呼吸變化[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院學報，1998，11（2）：19-23.

[9]楊金華，付慶云.雌雄異株植物銀杏特異蛋白初步分析[J].科技信息，2012，（31）：241-241.

（責任編輯：丁志祥）