摘 要 以海州常山的1年生莖段為外植體，比較不同消毒劑、消毒時(shí)間的消毒效果。消毒后的莖段接種到附加了不同濃度的6-BA和IAA的MS培養(yǎng)基中，篩選腋芽抽生的適宜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合。結(jié)果表明：外植體消毒的最佳方案是75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，有效材料獲得率高達(dá)62.0%。在誘導(dǎo)腋芽抽生培養(yǎng)中，以培養(yǎng)基“MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L”的配方效果最佳，腋芽萌動(dòng)率高達(dá)90.9%。

關(guān)鍵詞 海州常山；組織培養(yǎng)；莖段；外植體消毒；腋芽抽生

中圖分類號(hào)：S56；Q945.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）22-083-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20150908.1436.048.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015/9/8 14：36：58

海州常山（Clerodendrum trichotomum Thuhb）別名斑鳩菜、泡花樹，因葉大有特殊臭氣，又叫臭梧桐，為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum）落葉灌木或小喬木[1]。海州常山是一種風(fēng)味獨(dú)特的木本野生蔬菜，又是應(yīng)用很廣的藥用植物，在中藥材市場(chǎng)上的用量很大。此外，海州常山一株樹上花果共存，而且花果期長(zhǎng)，色澤亮麗，為良好的觀花、觀果園林植物；具有一定抗旱、耐淹、耐澇和抗污染的能力，對(duì)重金屬砷的耐受性和富集能力都較強(qiáng)，是砷污染地的理想修復(fù)樹種[2-3]。

海州常山市場(chǎng)需求量大，具有廣泛的開發(fā)利用前景，但種苗繁殖難是規(guī)?；N植的一個(gè)制約因素。由于扦插和分株的繁殖系數(shù)低，而種子發(fā)芽較困難，因此，組培快繁體系的建立，對(duì)海州常山種質(zhì)資源保護(hù)及規(guī)?；斯しN植都具有重要意義。

1材料與方法

1.1植物材料

試驗(yàn)材料為海州常山1年生帶腋芽莖段，取材于云南省楚雄市彝人古鎮(zhèn)。

1.2方法

1.2.1外植體消毒

將海州常山枝條去掉葉片，留葉柄0.2 cm左后，以保護(hù)腋芽免受機(jī)械損傷，先用洗衣粉液進(jìn)行清洗，然后流水沖洗5 h左后。沖凈后置于超凈工作臺(tái)上紫外燈照射10 min，后用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2次，再根據(jù)設(shè)計(jì)的消毒試驗(yàn)方案（表1）進(jìn)行消毒，在消毒液中加入2滴吐溫20。倒去消毒液，用無(wú)菌水漂洗5～7次，吸干水分，將消毒后的莖段置于無(wú)菌濾紙，切去基部受損組織，接種于培養(yǎng)基上。通過(guò)對(duì)比不同消毒劑以及不同消毒時(shí)間的消毒效果，篩選合適的消毒劑及最佳消毒時(shí)間。

1.2.2初代培養(yǎng)

篩選最佳消毒劑及最佳消毒時(shí)間，參考劉慧春等人的方法[4]，采用MS+BA0.2+IAA0.1培養(yǎng)基。誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、IAA作為外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，共設(shè)計(jì)8種濃度配比（見表2）。附加3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH=6.0。將配制好的培養(yǎng)基置于121℃、0.12 MPa壓力下高溫滅菌30 min，培養(yǎng)溫度為23～25℃，光照度1500～2000 lx，光照12 h/d。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

對(duì)外植體消毒后的污染率、存活率及腋芽萌動(dòng)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[5-6]，每處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)公式如下。

污染率=（污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

存活率=（消毒后存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

腋芽萌動(dòng)率=（腋芽已萌動(dòng)的外植體數(shù)/接種存活的總外植體數(shù)）×100%

2結(jié)果與分析

2.1最適消毒劑及消毒時(shí)間的篩選

本試驗(yàn)采用75%酒精處理30 s后，分別用0.1%HgCl2、5%NaClO對(duì)外植體進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理。結(jié)果表明，不同消毒劑、不同消毒時(shí)間對(duì)海州常山莖段消毒效果表現(xiàn)不一，其污染率和存活率有所不同，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

莖段用75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒5 min時(shí)，污染率為48.6%，消毒后莖段褐化輕，后期長(zhǎng)勢(shì)好，芽萌動(dòng)快，抽生葉片為深綠色（圖1a）；消毒7 min時(shí)，莖段稍有褐化現(xiàn)象，但后期恢復(fù)快，整體長(zhǎng)勢(shì)好，存活率高達(dá)62%，消毒效果最好（圖1b、圖2）；消毒10 min時(shí)，外植體汞中毒較深，部分外植體褐化死亡，腋芽后期抽生緩慢（圖1c）；當(dāng)消毒15 min時(shí)，汞中毒很深，60%以上的外植體褐化死亡，存活率僅有30%，腋芽抽生極為緩慢。

莖段用75%酒精30 s+5%NaClO消毒3 min時(shí)，無(wú)褐化現(xiàn)象，接種160個(gè)莖段，僅有4個(gè)莖段存活，污染率為97.5%，存活率為2.5%；當(dāng)消毒7 min時(shí)，莖段褐化非常嚴(yán)重，70%的外植體因褐化死亡，存活率僅有15%，且后期腋芽抽生困難；而消毒時(shí)間為5 min時(shí)，效果最好，存活率最高達(dá)30%，后期腋芽抽生相對(duì)緩慢。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，海州常山外植體（莖段）進(jìn)行消毒最適方案為75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，污染率低，存活率最高。

2.2誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生培養(yǎng)基的篩選

以篩選出的適宜消毒方法，75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，設(shè)計(jì)8個(gè)不同濃度配比的培養(yǎng)基（見表2），試驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同濃度配比對(duì)誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生效果表現(xiàn)不一，其7 d液芽萌動(dòng)率跟15 d腋芽萌動(dòng)率均有所不同（見表4）。

分析7 d和15 d的腋芽抽生情況，其中5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)培養(yǎng)基腋芽抽生相對(duì)緩慢，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)培養(yǎng)基腋芽抽生相對(duì)較快，故6-BA濃度為0.2 mg/L最佳；1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)培養(yǎng)基腋芽萌動(dòng)率以1號(hào)、2號(hào)較高，1號(hào)最高，故低濃度的IAA更有助于腋芽的抽生。所以1號(hào)培養(yǎng)基“MS+BA0.2+IAA0.1”為誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生的最佳培養(yǎng)基。

3討論

3.1防止褐變的方法

褐變?cè)诤Ｖ莩Ｉ浇M培過(guò)程中普遍存在，能否有效控制褐變是決定組培成功的關(guān)鍵?？梢圆扇∫韵路乐狗椒?。

（1）通常取幼齡部位進(jìn)行組織培養(yǎng)不易褐變，但隨著組織的老齡化，植物組織內(nèi)醌類物質(zhì)增多而褐變嚴(yán)重[7]，選擇外植體時(shí)應(yīng)盡量選擇腋芽飽滿、無(wú)病蟲害的1年生枝條。

（2）春夏季特別是春季取材的褐變情況較輕，外植體生長(zhǎng)旺盛，分生能力強(qiáng)且不易褐變，而以已經(jīng)木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)則褐變嚴(yán)重，因此組培盡量在春季進(jìn)行并選擇半木質(zhì)化枝條。

（3）外植體受傷程度較小時(shí)褐變更易控制[8]，所以平常取材時(shí)應(yīng)盡量減少傷口面，保持材料的完整性。

（4）適當(dāng)添加抗氧化劑及吸附劑，前者抑制多酚氧化，后者吸附氧化物，從而減輕對(duì)組織培養(yǎng)物的毒害。

3.2選擇合適的消毒方案

對(duì)大多數(shù)外植體只需要進(jìn)行表面消毒即可，外植體表面消毒的關(guān)鍵在于選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間。不同植物或同一植物不同外植體消毒的方法不同，本試驗(yàn)中所采取的7種不同消毒方式，其消毒結(jié)果存在明顯差異，所以為達(dá)到滿意的消毒效果，需根據(jù)外植體情況，選擇多種類消毒方式進(jìn)行試驗(yàn)，摸索出適宜的消毒劑及最佳消毒時(shí)間。

3.3誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比

試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的6-BA與低濃度的IAA更有助于腋芽的抽生。最適培養(yǎng)基為1號(hào)“MS+BA0.2+IAA0.1”，此試驗(yàn)結(jié)果與劉慧春[4]等人在豆腐柴組培試驗(yàn)中的結(jié)果一致，低濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比更有利于腋芽抽生。

4小結(jié)

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，初步確立海州常山外植體（莖段）消毒處理的最適方案為75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，污染率低，存活率最高。誘導(dǎo)腋芽抽生1號(hào)培養(yǎng)基速度最快，15 d腋芽萌動(dòng)率最高，高達(dá)90.9%，所以“MS+BA0.2+IAA0.1”為誘導(dǎo)海州常山腋芽抽生的最佳培養(yǎng)基。

參考文獻(xiàn)：

[1]曾現(xiàn)艷.海州常山種質(zhì)資源遺傳多樣性的初步研究[D].濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[2]謝福春.海州常山的生長(zhǎng)特性與抗逆性研究[D].濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3]Mahmud R，Inoue N，Kasajima SY，et al.Assessment of potentia1 indigenous plant species for the Phytoremediation of Arsenic-contaminated areas of Bangladesh[J].International Journal of Phytoremediation，2008，10（2）：117-130.

[4]劉慧春，朱開元，金關(guān)榮，等.豆腐柴的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（1）：30-31.

[5]于婷喬.藍(lán)果忍冬組培快繁技術(shù)的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[6]王樹芝，劉德華，劉黎，等.冬青苦丁茶樹組織培養(yǎng)的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（2）：131-133.

[7]李佳，趙文龍，周長(zhǎng)艷，等.蓮藕愈傷組織誘導(dǎo)及組織學(xué)觀察[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（3）：701-703，717.

[8]Bonga J M，Durzan D J著.闕國(guó)寧譯.樹木組織培養(yǎng)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1988：25-26.

（責(zé)任編輯：丁志祥）