摘 要 組織培養(yǎng)技術(shù)對于芥菜類蔬菜育種材料的保存與繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源創(chuàng)制有著十分重要的意義。主要對芥菜類蔬菜器官離體培養(yǎng)的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，包括：外植體類型（子葉、帶柄子葉及下胚軸），外植體生理狀態(tài)（苗齡等），外植體極性（近根端、近芽端）與接種方式（正插、平放等）；培養(yǎng)基類型及生長調(diào)節(jié)劑組合濃度等。分析認(rèn)為，影響芥菜類蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過選擇適宜的外植體類型和最佳生理時期，改良培養(yǎng)基及優(yōu)化生長調(diào)節(jié)劑配比，優(yōu)化培養(yǎng)條件及使用培養(yǎng)基添加物，綜合所有的因素進(jìn)行優(yōu)化，才能獲得高效的芥菜類蔬菜離體培養(yǎng)再生體系。

關(guān)鍵詞 蔬菜；芥菜類；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基；生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號：S645.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）31-025-04

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芥菜類蔬菜屬于十字花科蕓薹屬芥菜種的一、二年生草本植物栽培變種群[1]，分為根芥、莖芥、葉芥、薹芥四種類型[2]。通常作為蔬菜、油料和調(diào)料作物栽培[1]。芥菜是我國重要的原產(chǎn)蔬菜種類，栽培歷史悠久，分布廣泛，種質(zhì)資源豐富。

植物離體培養(yǎng)具有占用空間小、繁殖速度快、培養(yǎng)物脫毒等特點，是現(xiàn)代農(nóng)作物育種、生產(chǎn)上常用的技術(shù)手段。在芥菜育種的研究中，離體培養(yǎng)技術(shù)可以作為實驗室育種的常規(guī)技術(shù)，保存難以獲得種子的材料，為今后芥菜細(xì)胞培養(yǎng)、遺傳研究、基因工程技術(shù)搭建技術(shù)平臺。本文綜述芥菜類蔬菜組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展。

1植物材料基因型

植物材料的基因類型直接影響著離體培養(yǎng)的效果，不同材料再生能力不同[3]。陳石頭[4]以五個不同品種榨菜子葉為外植體時，不定芽誘導(dǎo)率不明顯，而以子葉柄為外植體時，五個品種間不定芽的誘導(dǎo)率有明顯差異。余小林等[1]認(rèn)為不同的基因型嚴(yán)重影響著第一代愈傷組織的分化。沈進(jìn)娟等[5]認(rèn)為不同榨菜品種之間外植體不定芽的分化率差異明顯，“藺市草腰子”和“郫縣榨菜”容易誘導(dǎo)不定芽，而“永安小葉”不容易被誘導(dǎo)，其外植體的分化率均比較低。吳慧敏等[3]在葉用芥菜小孢子培養(yǎng)中，最終認(rèn)為不同基因型材料間胚狀體產(chǎn)量差異顯著。陳材林等[6]認(rèn)為芥菜類作物在自然選擇和人工選擇的共同影響下形成了一系列變異類型。付杰等[7]認(rèn)為在所有栽培作物中，芥菜變異的程度之大是少見的，是蕓薹屬植物在進(jìn)化上的一個典型種類。芥菜在組織培養(yǎng)中基因型差異嚴(yán)重影響了愈傷組織的誘導(dǎo)及愈傷組織的分化。何曉明[8]在菜薹研究中指出，所用6個菜薹品種在相同的培養(yǎng)基上不同品種間不定芽的分化能力有著明顯差異。

2植物外植體

2.1外植體類型

植物不同的外植體再生能力有很大的差異性，因此選擇合適的外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)是提高植株再生頻率的有效手段。目前在蕓薹屬植物上采用的外植體主要有子葉、帶柄子葉及下胚軸[9-15]。陳石頭等[4]在榨菜組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，榨菜子葉和帶柄子葉在不定芽誘導(dǎo)條件下，“浙桐1號”子葉再生芽分化頻率達(dá)到91.3%，帶柄子葉的不定芽再生率高達(dá)100%。沈進(jìn)娟等[5]也對此做了相關(guān)的研究，指出不同的外植體類型誘導(dǎo)不定芽的分化差異較大，其中子葉和帶柄子葉分化率較高，帶柄子葉分化率最高，下胚軸在不同分化培養(yǎng)基中不定芽的分化率均偏低。張艷梅等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，榨菜下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)90.0%，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)92.2%。黃欣等[17]在擬南芥再生體系的研究中指出，用真葉誘導(dǎo)愈傷時，處于花期的真葉出愈能力稍快于處于營養(yǎng)期的真葉。余小林等[1]在提高榨菜離體植株再生頻率的研究表明，不同外植體在適宜的培養(yǎng)基中的再生頻率差異明顯，其中下胚軸的不定芽再生頻率為最高，達(dá)到50%；子葉柄不定芽再生頻率為34.43%，帶柄子葉的不定芽再生頻率為16.67%，不定芽再生頻率最低的外植體是子葉，僅為33.33%。但就愈傷組織誘導(dǎo)頻率而言，誘導(dǎo)頻率最高的外植體卻為子葉柄，誘導(dǎo)頻率可達(dá)96.67%。

2.2外植體生理狀態(tài)

外植體的生理狀態(tài)對芥菜類蔬菜離體再生及分化頻率也有很大影響，不同生長期的無菌苗明顯影響外植體不定芽再生能力。一般情況下，幼嫩組織比老化組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力[18]。劉樂承等[19]在對蕓薹屬植物的研究中報道，以無菌苗的子葉、帶柄子葉和下胚軸等為外植體時，苗齡顯著影響芽再生頻率。陳石頭等[4]研究發(fā)現(xiàn)，子葉外植體的苗齡為4 d時分化能力最強，達(dá)到91.3%，隨著苗齡的增加，不定芽的分化頻率明顯降低；帶柄子葉則以5～6 d苗齡分化最佳，其中6 d苗齡的帶柄子葉，分化頻率高達(dá)100%。張艷梅等[16]在對榨菜下胚軸的再生體系的建立研究中指出，不同苗齡榨菜愈傷組織的誘導(dǎo)效果有顯著的差異，3 d苗齡榨菜幼苗的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，4 d苗齡誘導(dǎo)率最高，達(dá)到90%，但其后隨著榨菜苗齡的增加，誘導(dǎo)率逐漸下降。

2.3外植體極性與接種方式

離體培養(yǎng)中外植體的極性影響在芥菜類蔬菜中的研究報道較少。金波[20]認(rèn)為以下胚軸和花莖為外植體時，極性是影響芽再生的重要因素。一般認(rèn)為，近根端容易產(chǎn)生根，近芽端容易產(chǎn)生芽[19]。但李樹賢等[21]在結(jié)球甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)下胚軸不定芽的發(fā)生沒有明顯極性。

外植體的接種方式對芽的再生也有一定的影響。許多研究表明，插植較平放芽再生率要高[22-23]。朱麗華等[24]對大白菜下胚軸接種方式的研究表明，以近根端插入培養(yǎng)基的正插方式明顯有利于不定芽的再生。張艷梅等[16]在對榨菜下胚軸的研究中全部采用平放，在不同生長調(diào)節(jié)劑濃度的配比中，不定芽的最高誘導(dǎo)率為92.2%，不定根的最高誘導(dǎo)率為97.8%。

3培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑組合濃度

3.1培養(yǎng)基

芥菜離體培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基為MS、B5。黃欣[17]在擬南芥的研究中選用B5培養(yǎng)基，在不同生長調(diào)節(jié)劑配比下外植體均有愈傷組織形成。沈進(jìn)娟[5]選用B5和MS為基本培養(yǎng)基，探討不同基因型在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽分化的差異，以B5培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基時，不同榨菜品種之間外植體不定芽分化率差異不大；以MS培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基時，不同榨菜品種之間外植體不定芽的分化率差異明顯，“藺市草腰子”和“郫縣榨菜”容易誘導(dǎo)不定芽，其中“藺市草腰子”的帶柄子葉不定芽分化率達(dá)到94.4%，“郫縣榨菜”的子葉不定芽分化率達(dá)到80.0%，而“永安小葉”不容易被誘導(dǎo)，其外植體的分化率較低。余小林等[1]以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用不同生長調(diào)節(jié)劑組合來研究榨菜間接不定芽發(fā)生情況，建立了高效的榨菜離體培養(yǎng)再生體系。張艷梅等[16]的研究中選用MS培養(yǎng)基，其愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到了47.8%。孫全等[25]的研究中，也以MS培養(yǎng)基為主，在不同生長調(diào)節(jié)劑組合中，外植體最大分化率達(dá)97%，成苗率最大值為73%以上。陳石頭等[4]研究中表明，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)榨菜子葉和帶柄子葉不定芽，浙桐1號榨菜子葉再生芽分化頻率達(dá)91.3%，帶柄子葉的不定芽再生率高達(dá)100%。

3.2生長調(diào)節(jié)劑類型及組合濃度

芥菜組織培養(yǎng)很難得到完全脫分化的愈傷組織，在沒有添加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，其外植體只能生根而不能形成愈傷組織[26]。生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中有著至關(guān)重要的作用，是誘導(dǎo)愈傷及植株再生的決定性因素，因此尋求適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)劑類型及配比濃度是提高愈傷及芽再生頻率的重要途徑[19]。在芥菜的組織培養(yǎng)中最常用的生長調(diào)節(jié)劑有NAA、6-BA、2，4-D等。不同基因型品種以及外植體對生長調(diào)節(jié)劑組成的要求有顯著差異。余小林等[1]在榨菜的研究中報道，在2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中，榨菜愈傷組織誘導(dǎo)頻率和不定芽再生頻率均為最高，下胚軸、子葉柄、帶柄子葉、子葉等不同外植體在上述培養(yǎng)基中的再生頻率差異很大，分別為50%、34.43%、16.67%、33.33%。同時，在此生長調(diào)節(jié)劑濃度組合下，愈傷組織誘導(dǎo)頻率最高的外植體為子葉柄，誘導(dǎo)率達(dá)96.67%。使用1.5 mg/L CPPU+0.2 mg/L 2，4-D濃度配比的組合結(jié)果表明，不論是愈傷組織誘導(dǎo)還是不定芽的分化，均好于6-BA與2，4-D的組合，也最適合不定芽的分化，但不同的外植體類型在此組合中的再生頻率是不一樣的，其中帶柄子葉外植體的再生頻率最高，達(dá)66.67%，子葉、子葉柄和下胚軸在以上組合中的不定芽再生頻率分別為36.67%、5%和1.67%。陳石頭等[4]使用6-BA與NAA的生長調(diào)節(jié)劑組合研究榨菜子葉及帶柄子葉的再生體系，認(rèn)為2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA為子葉的最佳分化濃度。帶柄子葉的優(yōu)化培養(yǎng)基則為MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +5.0 mg/L AgNO3。張艷梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與NAA、6-BA與2，4-D的配比組合，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA，不定芽誘導(dǎo)的最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，不定根誘導(dǎo)的最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.2 mg/L NAA。沈進(jìn)娟[5]等的研究表明，分化培養(yǎng)基中添加2 mg/L 6-BA、0.2～0.4 mg/L NAA時，不定芽分化率最高。

4硝酸銀

Chi等[27-28]首先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硝酸銀顯著促進(jìn)大白菜、白菜和菜心的子葉再生率。硝酸銀作為一種乙烯抑制劑，能通過促進(jìn)多胺的合成提高體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生的頻率[29]。因此AgNO3在蕓薹屬植物組織培養(yǎng)中被廣泛運用，濃度在4～10 mg/L可顯著增加不定芽的分化率[30-37]。陳石頭[4]認(rèn)為，添加5 mg/L AgNO3能促進(jìn)帶柄子葉的分化。沈進(jìn)娟[5]在分化培養(yǎng)基中也添加了5 mg/L AgNO3，認(rèn)為添加適宜的AgNO3更有利于不定芽分化。

5結(jié)束語

影響芥菜類蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過選擇適宜的外植體類型和最佳生理時期，改良培養(yǎng)基及優(yōu)化生長調(diào)節(jié)劑配比，優(yōu)化培養(yǎng)條件及使用培養(yǎng)基添加物，綜合所有的因素進(jìn)行優(yōu)化，才能獲得高效的芥菜類蔬菜離體培養(yǎng)再生體系。從總體研究來看，芥菜類蔬菜離體再生系統(tǒng)仍不完善，再生頻率普遍不高，有關(guān)提高芥菜類蔬菜離體再生頻率的研究仍需進(jìn)一步加強，以便為今后芥菜類蔬菜新品種選育、遺傳轉(zhuǎn)化研究打下堅實的基礎(chǔ)。

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