王 鋒，孫君社，胡紹峰，張秀清*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

巴戟天（Morinda officinalis）為茜草科植物巴戟天的干燥根，味甘辛，性微溫，有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效[1]。巴戟天含有多糖類、環(huán)烯醚萜苷類和蒽醌類等多種化學(xué)成分，其中豐富的多糖作為補(bǔ)腎壯陽的主要有效成分，能夠?qū)θ祟惥又械拿撗鹾颂呛怂幔╠eoxyribonucleic acid，DNA）起到保護(hù)作用[2]，同時(shí)其還具有治療老年癡呆癥[3]、抗疲勞等生理作用[4]。水晶蘭苷作為巴戟天環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的一種重要成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]，能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡[6]，是巴戟天發(fā)揮祛風(fēng)濕作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。巴戟天中含有多種蒽醌類化合物，研究表明，巴戟天中提取出的蒽醌對于糖尿病的治療具有幫助作用[7]。目前已經(jīng)從巴戟天中分離并鑒定的蒽醌類成分共有34種，蒽醌類物質(zhì)能夠增加成骨細(xì)胞抗骨質(zhì)疏松的能力[8]，并且具有抗菌、抗癌、抗病毒、凝血等生物活性，但是近幾年的研究表明蒽醌類化合物在體內(nèi)蓄積會導(dǎo)致肝腎損傷[9]，而蒽醌類化合物的藥效毒效雙向作用與其含量有較大的關(guān)系，因此研究巴戟天中的蒽醌含量具有重要意義。

巴戟天入藥前需要經(jīng)過炮制，其炮制的方法主要有鹽制、蒸制、甘草水制、煮制，目前巴戟天的炮制研究主要集中在鹽制上。巴戟天的主要功效之一是補(bǔ)腎壯陽，而鹽性寒，有補(bǔ)腎、軟堅(jiān)、涼血解毒的作用，用鹽制巴戟天可引藥入腎，達(dá)到助陽補(bǔ)腎之功[10]。鹽制巴戟天的方法主要是用食鹽水拌勻，浸漬一定時(shí)間，置于適宜蒸制容器內(nèi)加熱蒸透，趁熱抽去木心，切片，干燥。

本試驗(yàn)選擇巴戟天中的多糖含量作為指標(biāo)，對巴戟天鹽制方法中的3個(gè)主要影響因素：氯化鈉的質(zhì)量濃度、浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以確定鹽制過程的最佳工藝。并通過測定巴戟天炮制前后其主要活性成分水晶蘭苷的含量變化情況，為巴戟天炮制品的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)，通過總蒽醌含量的變化情況為巴戟天的炮制機(jī)制解析提供一定試驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴戟天：采自廣東省肇慶地區(qū)；水晶蘭苷（色譜純）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；大黃素（純度≥99%）：中國藥品生物制品檢定所；葡萄糖（純度≥99%）：北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：西隴化工股份有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸等（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200系列高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Aglient公司；酸度計(jì)PB-10：德國Sartourius公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器廠；TG 16-WS臺式高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巴戟天炮制工藝的優(yōu)化

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚硫酸法進(jìn)行測定[19]，標(biāo)曲繪制方法為：準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100mL，取出1mL該溶液定容至100mL，配成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于比色管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL。靜置10 min后，搖勻，待反應(yīng)液完全冷卻后，于波長490 nm條件下測定其吸光度值，以水作空白試驗(yàn)。以吸光度值為橫坐標(biāo)，多糖含量為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品中多糖的測定

稱取已過60目篩的巴戟天粉末0.200 g，按照料液比為1∶40（g∶mL）加入5%的NaOH溶液，超聲提?。?0 W）30 min，4 000 r/min離心15 min，取一定體積的上清液，調(diào)節(jié)pH值至中性（6.8～7.2）；再加入4倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，置于4 ℃冰箱中。靜置12 h后離心（4 000 r/min、10 min），棄去上清液，用水復(fù)溶醇沉多糖后定容至50 mL。吸取樣品液1.2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法操作。以空白試劑作參比，在波長490 nm處測量吸光度值。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖的含量。多糖含量按下公式計(jì)算：

式中：w為多糖含量，mg/g；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測定液的葡萄糖含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質(zhì)量，g；V2為比色時(shí)所移取樣品測定液的體積，mL。

（3）巴戟天炮制的單因素試驗(yàn)

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稱取5 g的巴戟天樣品5份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻后浸泡50 min取出，蒸制相同時(shí)間后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過60目篩，測定多糖含量。

浸漬時(shí)間：稱取5 g的巴戟天樣品6份，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻，分別浸泡10 min、30 min、50 min、70 min、90 min、110 min后取出樣品，蒸制相同時(shí)間后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過60目篩，測定多糖含量。

蒸制時(shí)間：稱取5 g的巴戟天樣品6份，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻，浸泡50 min后取出樣品，依次蒸制15 min、35 min、55 min、75 min、95 min、115 min后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過60目篩，測定多糖含量。

（4）巴戟天炮制的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間這3個(gè)因素分別選擇3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇出巴戟天炮制過程中的最佳工藝，對最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 巴戟天炮制工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for Morinda officinalis processing technology optimization

1.3.2 巴戟天炮制前后水晶蘭苷的測定

（1）色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%磷酸溶液-甲醇（10%～90%）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：231 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以該標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液，分別配制質(zhì)量濃度為25.000 μg/mL、12.500 μg/mL、6.250 μg/mL、3.125 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測，以各質(zhì)量濃度的水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的水晶蘭苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作水晶蘭苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品中水晶蘭苷含量的測定

稱取已過60目篩的樣品粉末0.500 g至三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲處理（500 W、53 kHz）30 min，抽濾，向不溶物中再加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇超聲提取30 min，抽濾，合并濾液于圓底燒瓶中。將濾液旋蒸至干，向圓底燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，在超聲水浴中重新溶解分析物，溶解后用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇定容至50 mL，搖勻，溶液過0.45 μm微孔濾膜過濾器，收集濾液上HPLC儀測定。樣品中水晶蘭苷含量按下公式計(jì)算：

式中：w為水晶蘭苷含量，mg/g；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測定液水晶蘭苷的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 巴戟天炮制前后總蒽醌含量的測定

（1）大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取大黃素標(biāo)品10 mg，用甲醇定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

最大吸收波長的選擇：取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，沸水浴揮干甲醇，加5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，在190～700 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示其最大吸收峰在310 nm，因此檢測波長選擇310 nm。

反應(yīng)時(shí)間的選擇：取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，沸水浴揮干甲醇，加5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，分別反應(yīng)0、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min于波長310 nm處測定其吸光度值，結(jié)果顯示，在30 min后，其吸光度值達(dá)到了穩(wěn)定，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為30 min。

大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，水浴揮干甲醇，加入5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，放置30 min后，于波長310 nm處測定吸光度值。

（2）總蒽醌的提取及測定方法

稱取已過60目篩的樣品粉末2.000 g，加入2.5 mol/L的硫酸30 mL，在沸水浴上回流提取2 h，取出后冷卻至室溫。向溶液中加入20 mL氯仿，置于62 ℃的水浴上回流提取30 min。將提取溶液進(jìn)行萃取，收集下層的氯仿溶液，向上層液體中繼續(xù)加入20 mL氯仿，進(jìn)行水浴回流提取，重復(fù)以上步驟，直至氯仿層為無色。將得到的氯仿層溶液進(jìn)行混合，棄去上層液體。向氯仿溶液中加入20 mL蒸餾水進(jìn)行洗滌，洗滌數(shù)次，直至水層無色，棄去水層。向氯仿溶液中加入20 mL的5%氫氧化鈉-2%氨水的混合堿溶液，收集混合堿液，向氯仿液中再次加入混合堿液，重復(fù)操作，直至堿液層為無色，收集混合堿液層。向混合堿液中加入氯仿20 mL，混勻后靜置萃取，棄去氯仿層，收集混合溶液層，重復(fù)加入氯仿萃取，直至氯仿層為無色。將收集到的堿液層用5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液定容至250 mL，取該溶液于波長310 nm處測定吸光度值。樣品中總蒽醌含量按下公式計(jì)算：

式中：w為總蒽醌含量，mg/g；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測定液大黃素的含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質(zhì)量，g；V2為比色時(shí)所移取樣品測定液的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)；水晶蘭苷質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)；大黃素含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)；繪制葡萄糖、水晶蘭苷、大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖(A)、水晶蘭苷(B)及大黃素(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose (A),monotropein (B) and emodin (C)

2.2 巴戟天炮制工藝的單因素試驗(yàn)

選取氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間以及蒸制時(shí)間3個(gè)影響巴戟天炮制效果的因素做單因素試驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的合適范圍。如圖2a所示，在2%～4%的NaCl含量處理范圍內(nèi)，4%的NaCl含量處理所得巴戟天的多糖含量最高達(dá)到17.217 mg/g，顯著高于其他NaCl含量處理組。如圖2b所示，在10～120 min的考察范圍內(nèi)，50 min的浸漬處理最好，其多糖含量最高達(dá)到17.148 mg/g，而時(shí)間不足或者過長都會使得多糖含量降低。如圖2c所示，在15～115 min的考察范圍內(nèi)，15～95 min，多糖含量逐漸升高，在蒸制95 min時(shí)多糖的含量最高為17.738 mg/g，＞95 min后多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢。單因素試驗(yàn)的結(jié)果為：選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉，浸漬50 min，蒸制95 min，多糖含量最高。

圖2 氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(a)、浸漬時(shí)間(b)及蒸制時(shí)間(c)對多糖含量的影響Fig.2 Effects of NaCl concentration (a),soaking time (b) and steaming time (c) on polysaccharide content

2.3 炮制工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)

由于巴戟天炮制樣品中的多糖含量實(shí)際上是受到氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間、蒸制時(shí)間3個(gè)因素交叉影響，為了全面考察這3個(gè)因素的影響，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，以確定最佳炮制工藝的參數(shù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，各因素分別選擇3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果及分析見表2，方差分析見表3。

表2 巴戟天炮制工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for Morinda officinalis processing technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，各因素對鹽巴戟天多糖含量影響的大小關(guān)系為：A＞C＞B，即氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蒸制時(shí)間＞浸漬時(shí)間。試驗(yàn)確定的最佳組合為A2B2C2，即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液浸漬50 min，加熱蒸制95 min，趁熱除去木心。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖含量平均值為17.443 mg/g，高于其他組合，且有較好的重復(fù)性，說明該工藝可確定為巴戟天炮制的最優(yōu)工藝。

由表3可知，3個(gè)因素中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間對結(jié)果影響均不顯著。

由于巴戟天發(fā)揮其主要藥理作用的物質(zhì)是多糖，因此選用多糖作為巴戟天工藝優(yōu)化的評價(jià)指標(biāo)要比一些研究者選用水晶蘭苷以及蒽醌含量作為評價(jià)指標(biāo)[11-12]具有更高的可靠性。該工藝與其他研究者得到的巴戟天炮制工藝[13]相比，具有節(jié)省時(shí)間、成本、能源的優(yōu)勢，對于生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

2.4 巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌含量的測定

巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌的含量結(jié)果見表5。由表5可知，按照最優(yōu)的炮制工藝處理巴戟天樣品后，其中的水晶蘭苷和總蒽醌的含量較未處理之前依次降低了7.18%和10.54%。

炮制后水晶蘭苷的含量有所降低，其原因可能是由于水晶蘭苷作為環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含羧基和較多羥基等極性基團(tuán)，在炮制過程中加入氯化鈉使得部分水晶蘭苷溶解到氯化鈉溶液中，導(dǎo)致了水晶蘭苷的丟失，使含量降低[14]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與景海漪等[15]的研究結(jié)論一致，因此對于巴戟天的生品和炮制品在質(zhì)量控制時(shí)水晶蘭苷含量應(yīng)設(shè)定不同的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)中巴戟天經(jīng)過炮制后總蒽醌的含量降低，其原因可能是蒽醌在蒸制的濕熱條件下不穩(wěn)定、發(fā)生降解所引起的[16]。蒽醌類物質(zhì)雖然具有多種生物活性，但許多含蒽醌類物質(zhì)的藥材在入藥之前需要經(jīng)過炮制，其炮制機(jī)理與蒽醌類化合物的含量有重要關(guān)系。研究者通過研究何首烏提取物對人體正常干細(xì)胞的作用表明，其中產(chǎn)生影響作用的物質(zhì)主要為大黃素，大黃素對于正常干細(xì)胞的作用具有雙重性，低劑量時(shí)能夠促進(jìn)干細(xì)胞的生長，而高劑量則會抑制干細(xì)胞的生長[17]。此外，蒽醌類物質(zhì)的藥效毒效雙向作用還與蒽醌類物質(zhì)存在的狀態(tài)有關(guān)，蒽醌類物質(zhì)按照存在狀態(tài)可以分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)蒽醌在腸道代謝過程中形成蒽酮這一類典型的毒物，從而對肝腎造成損害[18]。部分研究結(jié)果表明，未炮制的巴戟天中結(jié)合態(tài)蒽醌含量約占總蒽醌含量的80%，而炮制后其所占百分比降至50%[19]，因此巴戟天入藥前經(jīng)過炮制的機(jī)理可能是降低結(jié)合蒽醌的含量。

表4 巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌含量Table 4 The contents of monotropein and total anthraquinone in processed and crude pieces

3 結(jié)論

巴戟天在臨床使用中需要進(jìn)行炮制，消除或減少藥物的毒性、烈性和副作用，增強(qiáng)藥物的療效。鹽制作為一種普遍使用的方法，對其炮制工藝的研究具有很大的價(jià)值。本試驗(yàn)確定巴戟天最佳的炮制工藝為：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液浸漬50 min，加熱蒸制95 min，趁熱除去木心。并得到氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)是極顯著影響因素，而浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間為不顯著性影響因素。對炮制前后的水晶蘭苷和總蒽醌含量進(jìn)行測定，炮制后水晶蘭苷降低了7.18%，總蒽醌含量降低了10.54%。雖然該炮制工藝會造成巴戟天的有效成分水晶蘭苷含量的降低，但僅降低了總含量的7%，并未造成較大的損失；本次試驗(yàn)證明了總蒽醌含量在炮制過程中會降低，說明巴戟天炮制的機(jī)理可能是降低對肝腎有較大損傷的結(jié)合蒽醌的含量，因此在后期的研究中應(yīng)對游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量分別進(jìn)行測定，為巴戟天炮制機(jī)理提供更有利的證據(jù)。

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