張 璐

（山西省醫(yī)藥與生命科學研究院，山西 太原 030006）

酸棗（Ziziphus jujubaMill.）屬鼠李科棗屬植物，主要多分布于中國北方，其種仁入藥[1]。酸棗果肉營養(yǎng)豐富，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素及多種礦質(zhì)元素，具有較高的生物活性和食療價值，已經(jīng)開發(fā)的產(chǎn)品有酸棗汁、酸棗酒、酸棗果醬、酸棗糕等。有研究報道酸棗果肉有增強小鼠的肌力、記憶力、食欲等作用[2-4]。近年來對多糖的保健作用引起人們的廣泛的關注，發(fā)現(xiàn)很多植物多糖、食用菌多糖均具有多種生物活性[5-6]，但對酸棗果肉多糖的提取工藝及抗氧化作用報道的較少。因此，本研究以酸棗果肉為研究對象，采用熱水浸提法提取酸棗果肉多糖，正交試驗法考察料液比、提取溫度和提取時間3個因素對多糖提取率的影響。通過體外抗氧化評價體系研究酸棗果肉多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除活性，為酸棗的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸棗：采自山西省運城市降縣山區(qū)。

1.1.2 試劑

石油醚（分析純）、乙醇（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；氯仿（分析純）：上海潤捷化學試劑有限公司；正丁醇（分析純）：上海埃彼化學試劑有限公司，2,2-二苯代苦味肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrzyl，DPPH）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SCS-290電子天平：瑞士PRECISA；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器設備有限公司；UV757CRT紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸棗果肉預處理[7]

取新鮮酸棗去除果核，果肉在105 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩，按料液比1∶10（g∶mL），用沸程60～90 ℃的石油醚80 ℃回流脫脂2次，每次2 h，收集酸棗果肉濾渣，干燥，備用。

1.3.2 提取方法

取預處理過的酸棗果肉渣，按一定料液比設定不同的溫度浸提、過濾、合并濾液、濃縮，加入4倍體積分數(shù)為95%的乙醇，4 ℃醇沉多糖24 h，離心，收集多糖沉淀物。再將多糖溶解于適量的蒸餾水中，按Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，V/V）與多糖溶液1∶4（V/V）混勻，采用Sevage法去除蛋白3次，分液漏斗去除有機層，濃縮多糖水溶液醇沉多糖，真空干燥，得到酸棗果肉多糖[8]。

1.3.3 多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法對酸棗果肉多糖進行測定[9]。多糖提取率計算公式如下：

1.3.4 單因素試驗

分別準確稱取5.0 g酸棗果肉渣，固定提取溫度90 ℃，提取時間2 h，提取次數(shù)2次，在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），提取溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，提取時間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，提取次數(shù)1次、2次、3次條件下，考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對酸棗果肉多糖提取率的影響。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）設計正交試驗綜合考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）對試驗結(jié)果的影響，因素與水平見表1，每組做3次重復試驗。在選取的最佳條件下，進行3次驗證試驗，計算酸棗果肉多糖的提取率。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.6 酸棗果肉多糖體外抗氧化活性測定

（1）清除羥基自由基能力測定

采用H2O2/Fe2+氧化法測定酸棗果肉多糖清除羥基自由基的能力[10-12]。準確量取2 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，混勻，6 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，混勻，靜置10 min，加入6 mmol/L 的水楊酸0.5 mL，混勻，靜置30 min，于波長510 nm處測定吸光度值（Ai）。以VC為陽性對照，空白組以雙蒸水代替多糖溶液，測定吸光度值（A0）；對照組以蒸餾水代替水楊酸的多糖溶液測定吸光度值（Ac）。羥基自由基清除率計算公式如下：

（2）清除超氧陰離子自由基

采用鄰苯三酚自氧化法[13]，測定酸棗果肉多糖對（O2-·）的清除能力[14-15]。分別精確量取1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，各加入4.5 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和3.2 mL去離子水，25℃水浴中保溫30 min，再加入25℃水浴中預熱的6 mmol/L鄰苯三酚（用10 mmol/L鹽酸配制）0.3 mL，用分光光度計在波長320 nm處每30 s測定溶液的吸光度值（ΔAi）。以VC為陽性對照，對照組用等體積的去離子水代替樣品溶液，測定吸光度值（ΔA0），每個樣品測3個重復，取平均值。超氧陰離子清除率計算公式如下：

（3）清除2,2-二苯代苦味肼（DPPH）自由基[16-18]

取1 mL濃度為1.0×10-4mol/L 的DPPH溶液，用體積分數(shù)為75%乙醇定容至10 mL，以體積分數(shù)為75%乙醇為空白對照，用分光光度計于波長517 nm 處測定吸光度值（A0）。分別精確量取1mL質(zhì)量濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，各加入1 mL 濃度為1.0×10-4mol/L 的DPPH 溶液，用體積分數(shù)為75%乙醇溶劑定容至10 mL，以體積分數(shù)為75%乙醇為空白對照，用分光光度計于波長517 nm處測定吸光度值（Ai）；再分別量取0.5mL質(zhì)量濃度為10μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL酸棗果肉多糖水溶液，用體積分數(shù)為75%乙醇溶劑定容至10 mL，以VC為陽性對照，以體積分數(shù)為75%乙醇為空白對照，用分光光度計于波長517 nm 處測定吸光度值（Ac）。DPPH自由基清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1 可知，以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖標準品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為：y=0.007 4x+0.038 5，相關系數(shù)R2=0.999 1，表明線性關系良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對試驗結(jié)果的影響

圖2 料液比對試驗的結(jié)果影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，隨著料液比的增大，酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，料液比為1∶20（g∶mL）以后提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定1∶15（g∶mL）、1∶20（g∶mL）和1∶25（g∶mL）為正交試驗中料液比的3個水平。

2.2.2 提取溫度對試驗結(jié)果的影響

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，提取溫度提高到80 ℃以后酸棗果肉多糖的提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定80 ℃、90 ℃和100 ℃為正交試驗中提取溫度的3個水平。

2.2.3 提取時間對試驗結(jié)果的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，提取時間延長到2.0 h以后酸棗果肉多糖的提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定1.5 h、2.0 h和2.5 h為正交試驗中提取時間的3個水平。

圖4 提取時間對試驗結(jié)果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 提取次數(shù)對試驗結(jié)果的影響

圖5 提取次數(shù)對試驗結(jié)果的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharides

由圖5可知，第1次提取的酸棗果肉多糖得率最高，隨著提取次數(shù)的增多酸棗果肉多糖得率有所提高，但增幅不大，考慮提取成本費用，故提取2次為宜。

2.3 酸棗果肉提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎上，以多糖提取率為考察指標，采用L9（34）設計正交試驗綜合考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）的影響，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for the extraction conditions optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響酸棗果肉多糖提取得率的因素主次關系為：提取溫度對酸棗果肉多糖提取率影響最大，其次為料液比，提取時間對試驗結(jié)果的影響相對較小，其最佳提取條件為A2B3C2，即料液比1∶20（g∶mL），提取溫度100 ℃，提取時間2.0 h，提取2次。在此條件下進行驗證試驗（n=3），多糖提取率為（0.951±0.028）%。

由表3方差分析可知，提取溫度對試驗結(jié)果影響顯著（P＜0.05），料液比和提取時間對試驗結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.4 體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 酸棗果肉多糖清除羥基自由基的結(jié)果

圖6 酸棗果肉多糖對羥基自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of polysaccharides on hydroxyl radical

羥基自由基是活性氧中活性最強的一種自由基，其可以與細胞內(nèi)的一切有機化合物反應，通過破壞脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝來損傷細胞的結(jié)構與功能，導致機體病變。因此對羥基自由基清除率是抗氧化作用的一個重要指標。由圖6可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增大至1.0 mg/mL，對羥基自由基的清除能力也在增加。酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度達到1.0mg/mL時，清除率達最大值48.35%。多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增大至0.6 mg/mL，對·OH的清除率顯著增加；當多糖質(zhì)量濃度＞0.6 mg/mL，隨質(zhì)量濃度的增加，清除率增加減緩，但清除率均小于VC。因此，酸棗果肉多糖對羥自由基具有一定的清除效果。

2.4.2 酸棗果肉多糖清除超氧陰離子自由基結(jié)果

超氧陰離子自由基具有一定的毒性，還可以通過反應生成其他氧自由基，從而損傷機體引起疾病。由圖7可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從10 μg/mL增大至80 μg/mL，對超氧陰離子自由基的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度80 μg/mL時，對超氧陰離子自由基清除率達最大值43.77%，但清除率均小于VC。酸棗果肉多糖對超氧陰離子自由基也具有一定的清除效果。

圖7 酸棗果肉多糖對超氧陰離子自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of wild jujube polysaccharides on superoxide anion radical

2.4.3 酸棗果肉多糖清除DPPH自由基的結(jié)果

圖8 酸棗果肉多糖對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of wild jujube polysaccharides on DPPH radical

DPPH 是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，可以捕獲或清除其他的自由基，而被廣泛用于測定生試樣的抗氧化能力。由圖8 可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從10 μg/mL增大至80 μg/mL，對DPPH自由基的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度80 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達最大值52.76%，但清除率均小于VC。酸棗果肉多糖對超氧陰離子自由基也具有一定的清除效果。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優(yōu)化出酸棗果肉多糖的最佳提取條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度100 ℃下，提取時間2.0 h，提取2次。在此條件下多糖提取率為（0.951±0.028）%。對酸棗果肉多糖的抗氧化活性的研究表明，酸棗果肉多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，對·OH的清除率為48.35%；在多糖質(zhì)量濃度為80 μg/mL時，對O2-·的清除率為43.77%，對DPPH自由基的清除率為52.76%。酸棗果肉多糖具有一定的開發(fā)利用價值，本研究結(jié)果為酸棗的多功能產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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