李文武, 殷光文, 林 希, 黃志堅(jiān), 林建斌, 江和基, 朱慶國

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350002; 2.福建省淡水水產(chǎn)研究所, 福建 福州 350002 )

魚類血清指標(biāo)分析能反映魚類品種的特性及生理狀態(tài), 是研究魚類血清非特異性免疫和血清生化特性的重要內(nèi)容[1]。魚機(jī)體出現(xiàn)病變時(shí), 其血清指標(biāo)會(huì)發(fā)生變化, 通過檢測血清相關(guān)指標(biāo)的變化, 可以對魚的病理情況做出診斷[2]。已有研究表明, 魚類血清指標(biāo)的變化范圍較大, 與品種、年齡及生長環(huán)境等因素有關(guān)[3]。

海帶粗多糖是從海帶中提純的多糖成分, 包括褐藻膠、褐藻糖膠和海帶淀粉[4-5], 具有廣泛的生物活性。目前國內(nèi)外研究已表明海帶粗多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。近年來, 也有研究表明海帶粗多糖對肥胖和糖尿病有緩解和治療作用[6]。對于多糖對魚類血清指標(biāo)影響的研究, 國內(nèi)外已有相關(guān)研究和報(bào)道[7-11], 但對斜帶石斑魚血清研究較少,僅張海發(fā)等[12]對斜帶石斑魚血清性狀及生化指標(biāo)的研究較為全面, 對海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清指標(biāo)影響的研究也尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過在基礎(chǔ)魚飼料中添加不同比例的海帶粗多糖, 研究海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化和非特異性免疫指標(biāo)的影響, 旨在摸索出海帶粗多糖作為魚飼料添加劑的最佳添加比例, 豐富藻類多糖促進(jìn)水產(chǎn)病害綠色防治的基礎(chǔ)研究[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚為福建廈門小嶝水產(chǎn)養(yǎng)殖場人工培育的斜帶石斑魚幼魚, 平均體質(zhì)量為90 g±2.6 g, 平均體長為15 cm±2.25 cm。石斑魚魚苗運(yùn)到福建省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖試驗(yàn)場地, 放入暫養(yǎng)水桶中馴養(yǎng)兩周,用10 mg/L的土霉素溶液消毒, 選取體格健壯、大小規(guī)格基本一致的個(gè)體, 隨機(jī)放入8個(gè)150 L的水族箱中, 每組2缸, 每缸15尾, 每缸配備一臺(tái)小型循環(huán)過濾器來凈化水體, 稱量初始體質(zhì)量后開始試驗(yàn)。每天8: 00~8: 30和17: 00~17: 30定時(shí)投喂, 每次達(dá)到表觀飽食后停止投喂(投喂量約為體質(zhì)量的 3%)。每天檢測水質(zhì)情況, 每天清洗循環(huán)過濾器, 每周清洗水缸,并用土霉素消毒。試驗(yàn)用水為一級(jí)過濾海水, 避光飼養(yǎng), 用增氧機(jī)晝夜持續(xù)增氧, 每次投喂1 h后吸出糞便, 每天傍晚換水約1/3~1/2, 以保持水質(zhì)清新。試驗(yàn)期間, 水溫 24~30℃, pH 值為 8.0±0.3, 溶氧質(zhì)量濃度>7.0 mg/L, 氨氮質(zhì)量濃度<0.2 mg/L。試驗(yàn)期為48 d。

1.2 試驗(yàn)期日糧的配制

海帶粗多糖購自愛迪森(北京)生物科技有限公司, 主要成分為褐藻膠、褐藻糖膠和海帶淀粉, 總糖含量 38.9%。在粉狀飼料(購自福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司)中分別添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%飼料營養(yǎng)成分(表1), 對應(yīng)分別為對照組、0.5%組、1.0%組、1.5%組。各組飼料原料混勻后制成4 mm粒徑的軟顆粒料, 之后分裝入自封袋, 置于 4℃冰箱冷藏備用, 軟顆粒料每3 d制作1批, 棄去3 d剩下的飼料,用新料投喂。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分表Tab.1 Nutrition of the basal diet

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后, 禁食 24 h, 每缸魚整體稱質(zhì)量后,隨機(jī)取10尾魚, 用毛巾包裹并蒙住眼睛, 2.5 mL采血針心臟采集血清, 4℃冰箱靜置過夜, 吸取上清液,–40℃保存待檢。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 血清細(xì)胞因子測定

細(xì)胞因子 IL-2、IL-6和 IFN-α的測定均采用ELISA法測定。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供, 操作按說明書進(jìn)行。

1.4.2 血清生化測定

血清生化測定采用IDEXX VetTest?獸醫(yī)全自動(dòng)干式生化分析儀(購自北京安普生化科技有限公司),按顯示屏指示下的簡單操作步驟, 自動(dòng)滴注血清樣品, 快速給出并打印檢測報(bào)告。

1.4.3 血清免疫指標(biāo)測定

SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法; C3、C4和LZM活性測定采用比濁法;AKLP活性測定采用對硝基苯磷酸鹽法。所用試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所, 操作按各說明書進(jìn)行。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件中方差分析(ANOVE)進(jìn)行單因素?cái)?shù)理統(tǒng)計(jì), 并對均數(shù)做LSD多重比較, 結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清細(xì)胞因子水平的影響

如表2所示, 與對照組相比, 各實(shí)驗(yàn)組血清中IL-2、IL-6與IFN-α水平均有一定程度的提高。其中0.5%組各因子水平均極顯著高于對照組(P<0.01);1.0%組 IL-2與 IL-6水平均極顯著高于對照組(P<0.01), IFN-α水平顯著高于對照組(P<0.05); 1.5%組IL-2、IL-6與IFN-α水平均高于對照組, 但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

表2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清中細(xì)胞因子水平的影響Tab.2 Effect of laminarin on serum cytokines in Epinephelus coioides

2.2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清非特異性免疫的影響

由表3可見, 與對照組相比, 各實(shí)驗(yàn)組 LZM、CAT、SOD的活力均有所提高, C3、C4含量均有一定程度的降低。其中, 隨添加量的增加, CAT和SOD活性逐漸下降, LZM先降后升, C3、C4含量逐漸升高, 但均低于對照組; 0.5%組LZM活性顯著高于對照組(P<0.05), CAT和 SOD活性極顯著高于對照組(P<0.01), C3含量顯著低于對照組(P<0.05), C4含量極顯著低于對照組(P<0.01); 1.0%組CAT活力顯著高于對照組(P<0.05), C4含量顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab.3 Effect of laminarin on non-specific immune response in Epinephelus coioides

2.3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化指標(biāo)的影響

由表4可見, 經(jīng)過48 d的喂養(yǎng)試驗(yàn), 與對照組相比, 各試驗(yàn)組均能顯著提高血清TP含量, 其中0.5%組和1.0%組與對照組差異極顯著(P<0.01), 1.5%組與對照組差異顯著(P<0.05); 降低血清中 UREA水平,0.5%組與對照組相比差異顯著(P<0.05), 但 1.0%組和1.5%組差異不顯著(P>0.05); 降低CREA水平, 且隨添加量增加, CREA水平依次降低, 1.5%組與對照組相比差異顯著(P<0.05), 0.5%組和1.0%組差異不顯著(P>0.05); 雖0.5%組和1.5%組ALP值比對照組低,1.0%組比對照組高, 但差異均不顯著(P>0.05); 添加量為 0.5%時(shí)能顯著提高 AST酶活力(P<0.05), 添加量為1.0%與1.5%時(shí)其AST活力先降后升, 但差異均不顯著(P>0.05); 對于ALT, 各試驗(yàn)組與對照組相比,其ALT的酶活力變化不大, 差異不顯著(P>0.05)。

表4 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化指標(biāo)的影響Tab. 4 Effect of laminarin on plasma biochemical parameters in Epinephelus coioides

3 討論

3.1 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成分泌的一類生物活性小分子多肽, 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生理、參與組織修復(fù)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用。細(xì)胞因子IL-2、IL-6與IFN-α, 按來源分屬淋巴因子, 即由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生, 是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的信息物質(zhì)。脾臟是粒細(xì)胞發(fā)生的初始場所, Ryu等[14]研究發(fā)現(xiàn)海帶粗多糖能誘發(fā)小鼠脾細(xì)胞增生, 明顯增強(qiáng)細(xì)胞毒性 T細(xì)胞 (CTLs)和自然殺傷細(xì)胞(LAKs)的活性, 提高IL-2的表達(dá)量。Smith等[15]發(fā)現(xiàn)日糧添加300 mg/L LJPS能顯著提高LPS應(yīng)激的斷奶仔豬回腸和結(jié)腸 IL-6(P=0.0289)和 IL-8(P=0.0245)的表達(dá)量, 結(jié)果都佐證了海帶粗多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。本試驗(yàn)組中, 細(xì)胞因子IL-2、IL-6與IFN-α的水平均高于對照組, 表明海帶粗多糖能促進(jìn)斜帶石斑魚機(jī)體對3種細(xì)胞因子的分泌, 提高機(jī)體的免疫水平。其隨海帶粗多糖添加量的增加各因子的分泌水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性, 這可能與海帶粗多糖濃度有關(guān)。結(jié)果表明,海帶粗多糖具有促進(jìn)斜帶石斑魚血清 IL-2、IL-6與IFN-α的分泌和提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力, 對促進(jìn)石斑魚健康生長具有重要意義[16-17], 但在實(shí)際使用海帶粗多糖時(shí)要控制好所添加的含量。

3.2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響

LZM, 又稱細(xì)胞壁溶解酶, 廣泛存在于動(dòng)物黏液、血清等中, 能專一地溶解微生物細(xì)胞壁, 已有研究表明, 淡水魚和海水魚的血清都有溶菌酶的存在,是魚體體液中重要的非特異性免疫物質(zhì)。CAT又稱為觸酶, 是一種酶類清除劑, 以鐵卟啉為輔基, 它可促使H2O2分解為分子O2和H2O, 清除體內(nèi)的H2O2,從而使細(xì)胞免于遭受 H2O2的毒害, 是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子, 可對抗因氧自由基對機(jī)體細(xì)胞造成的損傷, 并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞, SOD的水平是機(jī)體健康與否的直觀指標(biāo)。Kang等[18]通過臨床試驗(yàn)證實(shí), 海帶能提高SOD和CAT的水平。Moroney等[19]研究新鮮豬肉的保質(zhì)期時(shí)也發(fā)現(xiàn), 海帶粗多糖能延長新鮮豬肉的保質(zhì)期, 提高機(jī)體內(nèi)總抗氧化水平。C3、C4是補(bǔ)體系統(tǒng)的重要組成部分, 參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫機(jī)制, 當(dāng)機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活, 會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力下降, 促使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng)或造成組織損傷, 引起病理變化。

本試驗(yàn)結(jié)果表明, 海帶粗多糖能提高斜帶石斑魚體內(nèi)LZM、CAT與SOD酶活力; 降低C3、C4水平, 且隨添加量增加呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性, 這可能與海帶粗多糖濃度有關(guān)。結(jié)果說明, 海帶粗多糖能提高石斑魚機(jī)體的抗氧化能力和非特異性免疫, 與枸杞多糖和靈芝多糖相似, 都能提高機(jī)體的非特異性免疫[20]。劉會(huì)娟[21]的研究表明, 100 mg/kg的海帶粗多糖能明顯提高大骨雞血清效價(jià), 對免疫功能有明顯的促進(jìn)作用, 與本試驗(yàn)結(jié)果一致。董學(xué)興等[22]的研究表明,海帶對SOD、CAT無顯著影響, 與本研究結(jié)果不同,這可能與魚品種和海帶粗多糖效價(jià)等因素有關(guān); Zhu等[23]發(fā)現(xiàn)三七中鼠李半乳糖醛酸聚糖具有固化補(bǔ)體的作用, Olafsdottir等[24]從地衣中分離的β-葡聚糖也具有抗補(bǔ)體活性。這說明, 從天然多糖中尋找抗補(bǔ)體活性成分已成為可能。試驗(yàn)也證明海帶粗多糖中具有抗補(bǔ)體活性成分。

3.3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化水平的影響

尿素氮和肌酐在一定程度上可反映腎小球?yàn)V過功能的損害程度。本試驗(yàn)飼喂不同含量的海帶粗多糖后可見, 斜帶石斑魚機(jī)體內(nèi)的UREA和CREA含量均有不同程度的降低, 這說明海帶粗多糖不會(huì)對魚體腎臟造成損傷, 反而會(huì)提高腎臟機(jī)能; ALT與AST主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)。肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT和AST就會(huì)升高。其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致, 與 ALP一起, 都是目前最常用的肝功能指標(biāo)。本研究可見, 海帶粗多糖能降低 ALP活性, 對AST和ALT活性影響不大, 這說明海帶粗多糖不會(huì)對肝臟造成損傷。張海發(fā)等[12]研究斜帶石斑魚血清性狀及血清生化時(shí)發(fā)現(xiàn), 成熟親魚的 ALT、AST活性都較低(4

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明, 海帶粗多糖能提高斜帶石斑魚血清非特異性免疫能力, 提高血清總蛋白含量,降低對腎臟的損傷, 能明顯提高斜帶石斑魚機(jī)體的免疫功能, 且作用與海帶粗多糖濃度直接相關(guān), 因而使用海帶粗多糖時(shí)要控制好濃度, 本實(shí)驗(yàn)中, 以0.5%添加量時(shí)效果最佳。

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