席延坡，林辰壹，劉俊霞，孫新領(lǐng)，鮑 亮，薛 梅，吳 慧

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052;2．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊830052)

花粉作為父本重要的基因流載體，與花粉育性一起決定了雄性親本的遺傳信息是否能夠傳遞給下一代［1］?；ǚ鄣膲勖蜕盍κ侵参镩L期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變化、保障自身在自然條件下繁殖成功的進(jìn)化結(jié)果，與花粉的競爭力、自交選擇、花粉傳播距離、花粉移出、花粉呈現(xiàn)以及柱頭可授期等密切相關(guān)［2］，因此，花粉的壽命和生活力一直是植物繁殖生物學(xué)重要的組成部分［3］。棱葉蒜(Allium caeruleum)，又稱棱葉薤［4］、蘭花山蒜［5］，在中國僅分布于新疆天山一帶的低山帶［4-6］，國外分布在俄羅斯伏爾加河下游到西伯利亞，是重要的野生蔥屬植物資源，具較高的食用、飼用、觀賞和藥用價(jià)值［6］。新疆不同地理位置分布的棱葉蒜居群間存在著二倍體、三倍體和四倍體的倍性分化［7］，然而不同倍性棱葉蒜繁殖特征尤其是花粉壽命以及活力特征尚未見報(bào)道。本研究以烏魯木齊市雅瑪里克山原生境下分布的二倍體棱葉蒜不同開花物候期的花粉為研究對象，比較并選擇二倍體棱葉蒜花粉適宜的培養(yǎng)方法及生活力檢測的方法，檢測其花粉活力和花粉萌發(fā)率變化規(guī)律。該研究結(jié)果將有助于克服雜交育種中親本花期不遇和遠(yuǎn)距離雜交的困難，提高植物育種效率，為該野生植物資源的遷地保護(hù)、引種馴化和雜交育種提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)，為其他倍性分化的野生棱葉蒜植物資源繁育系統(tǒng)研究和種質(zhì)資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

研究材料棱葉蒜(2n =2x)分布于烏魯木齊市雅瑪里 克 山 陰 坡 面，地 理 位 置 為44°07'26． 6″ N，87°34'11．8″ E，海拔983 m，為溫帶大陸性氣候，年平均降水量為208．4 mm，年平均日照數(shù)為2 813．5 h，年均無霜期179 d［8］。

1．2 花粉采集

基于棱葉蒜開花物候特征，在原生境下分別于棱葉蒜的開花始期、開花盛期和開花末期標(biāo)記完全伸出花被片還未散粉的、飽滿的、健康的花藥，基于前期研究成果根據(jù)開花動(dòng)態(tài)，采集當(dāng)日即將自然散粉的小花，置于無菌培養(yǎng)皿中帶回實(shí)驗(yàn)室后觀察，當(dāng)花藥開裂后立即測定花粉活力［9］。

1．3 花粉活力測定

分別采用聯(lián)苯胺α －萘酚法、0．5% 氯化三苯基四氮唑(TTC)法、醋酸洋紅法、碘-碘化鉀法(I2-KI)、孢粉染色法、紅墨水染色法和四甲基偶氮唑(MTT)法，共計(jì)7 種染色方法測定不同開花物候期的花粉活力［9-12］。將新鮮花粉置于載玻片上，分別滴入上述溶液，混合均勻后于25 ℃的恒溫箱內(nèi)靜置，聯(lián)苯胺α －萘酚處理15 min;0．5% TTC 處理20 min;醋酸洋紅處理2 ～3 min;I2-KI 處理5 min;孢粉染色處理15 min;紅墨水染色處理15 ～20 min 以及MTT 處理5 min。以經(jīng)過高溫殺死后的無活力花粉為對照。以花粉的著色率代表花粉活力，計(jì)算花粉活力百分率，花粉活力=(有活力的花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%。

1．4 花粉萌發(fā)率測定

采用二因素完全隨機(jī)的離體萌發(fā)法，進(jìn)行花粉萌發(fā)率測定的配方選擇與優(yōu)化［13］。蔗糖濃度分別為0、20、50、100、150 g·L－1，硼酸濃度分別為0、50、80、100、150 mg·L－1，各處理均添加3 g·L－1的瓊脂，用0．1 mol·L－1的NaOH 和1 mol·L－1的HCl 調(diào)節(jié)pH至5．8。取居群開花盛期的花粉進(jìn)行優(yōu)化配方檢測;取居群不同開花物候期的花粉進(jìn)行花粉萌發(fā)率變化特征測定。在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。以經(jīng)過高溫殺死的花粉為對照，以花粉管伸長長度超過或等于花粉粒直徑的2 倍記為萌發(fā)花粉。計(jì)算花粉活力和萌發(fā)率，花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)的花粉數(shù)目/花粉總數(shù))×100%。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

花粉活力和花粉萌發(fā)率試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)3 次，在10 ×10 倍光學(xué)顯微鏡(Motic 2000)下每張制片隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察并統(tǒng)計(jì)著色花粉或萌發(fā)花粉，每視野不少于30 ?；ǚ?。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS 17．0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析，用Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2．1 二倍體棱葉蒜花粉活力檢測方法的比較選擇

通過對不同開花物候期的花粉活力檢測表明，經(jīng)聯(lián)苯胺α －萘酚處理，有活力和無活力花粉均被染成淡黃色或淡紅色;經(jīng)TTC 處理，有活力和無活力花粉均無著色;經(jīng)醋酸洋紅處理，有活力和無活力花粉均呈現(xiàn)紅色;經(jīng)I2-KI 處理，花粉在極短的時(shí)間內(nèi)由黃色變成金黃色或黃褐色，著色和變色的速度都非?？?，肉眼無法觀察區(qū)分有活力花粉和無活力花粉;經(jīng)紅墨水染色，有活力和無活力花粉被染成淡紅色或無著色。研究結(jié)果表明，聯(lián)苯胺α － 萘酚法、TTC法、醋酸洋紅法、I2-KI、孢粉染色法和紅墨水法在測定棱葉蒜花粉活力過程中，各處理與對照之間無顯著差異(P ＞0．05)，沒有獲得可以鑒定花粉活性的有效特征，無法區(qū)分和判斷花粉是否存在活力，因而不適宜于二倍體棱葉蒜的花粉活力檢測。

經(jīng)MTT 處理后，有活力的花粉被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色，而無活力的花粉與對照均未被染色。雅瑪里克山居群的棱葉蒜在開花始期、開花盛期和開花末期花粉的平均壽命均在60 h 之內(nèi)。不同開花物候期的花粉活力變化規(guī)律一致，居群開花始期、盛期和末期的平均花粉活力分別為6．25%、6．60%和6．50%，方差分析結(jié)果表明，不同開花物候期相同散粉時(shí)間的花粉活力無顯著差異(P ＞0．05)。因此，相比其他6 種方法，MTT 花粉活力檢測方法可以顯著區(qū)分和判斷花粉是否存在活力，適宜于棱葉蒜的花粉活力檢測(圖1)。

2．2 二倍體棱葉蒜不同開花物候期的花粉活力變化特征

采用MTT 法檢測雅瑪里克山居群棱葉蒜的花粉活力(表1)。方差分析結(jié)果表明，隨著散粉后時(shí)間的延長，花粉活力下降，花粉著色由深藍(lán)色至淡藍(lán)色到無色，花粉活力存在顯著差異(P ＜0．05)。

在居群開花始期0 －4 h 花粉活力逐漸升高，散粉1 和4 h 的花粉著色率分別為51．66%和80．17%。平均花粉活力超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的1 －8 h，平均花粉活力為58．80%。散粉24 h，有活力花粉被染成淡藍(lán)色，著色率為12．66%，與散粉36、48 和60 h的花粉著色率之間不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花始期的有效花粉活力在24 h之內(nèi)。

在居群開花盛期0 －4 h 花粉活力逐漸升高，散粉1 和4 h 的花粉著色率分別為37．03%和84．64%。平均花粉活力超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的0 －10 h，平均花粉活力為53．69%。散粉48 h，有活力花粉被染成淡藍(lán)色，著色率為1．27%，與60 h 的花粉著色率之間不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花盛期的有效花粉活力在48 h 之內(nèi)。

在居群開花末期0 －4 h 花粉活力逐漸升高，散粉1 和4 h 的花粉著色率分別為32．83%和83．56%。平均花粉活力超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的0 －10 h，平均花粉活力為52．36%。散粉36 h，有活力花粉被染成淡藍(lán)色，著色率為5．86%，與48 和60 h 的花粉著色率之間不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花盛期的有效花粉活力在36 h 之內(nèi)。

表1 MTT 法測定棱葉蒜花粉活力Table 1 Pollen vitality determined by MTT method %

2．3 離體萌發(fā)法測定二倍體棱葉蒜花粉萌發(fā)率與配方優(yōu)化

離體萌發(fā)法的配方選擇與優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，不同濃度的硼酸和蔗糖對花粉萌發(fā)影響差異顯著(P ＜0．05)，在不含蔗糖和硼酸的培養(yǎng)基中，二倍體棱葉蒜的花粉萌發(fā)率僅為3．49%，在僅含有蔗糖成分的培養(yǎng)基中，隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢;在僅含有硼酸成分的培養(yǎng)基中，隨著硼酸濃度的升高，花粉萌發(fā)率也呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢，高濃度的蔗糖和硼酸均有抑制花粉萌發(fā)的作用，而當(dāng)蔗糖和硼酸濃度分別達(dá)到100 g·L－1和80 mg·L－1時(shí)，花粉萌發(fā)率為72．70%，是二倍體棱葉蒜花粉萌發(fā)的適宜濃度，其次，配方為50 g·L－1蔗糖加80 mg·L－1硼酸以及100 g·L－1蔗糖加100 mg·L－1硼酸下的花粉萌發(fā)率超過50%。方差分析結(jié)果表明，不同濃度的硼酸和蔗糖對花粉萌發(fā)影響差異顯著，蔗糖和花粉對花粉的萌發(fā)有互作效應(yīng)(表3)。

2．4 離體萌發(fā)法檢測二倍體棱葉蒜不同開花物候期的花粉萌發(fā)率

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方法檢測雅瑪里克山居群棱葉蒜的花粉萌發(fā)率(表4)。方差分析結(jié)果表明，隨著散粉后時(shí)間的延長，花粉活力下降，花粉管萌發(fā)長度由長到短，花粉萌發(fā)率由高到低，花粉活力存在顯著差異(P ＜0．05)。

在居群開花始期0 －4 h 花粉萌發(fā)率逐漸升高，花粉萌發(fā)率由散粉1 h 的32．81%至4 h 的76．97%。平均花粉萌發(fā)率超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的0 －8 h，平均花粉活力為51．64%。散粉24 h 后的萌發(fā)率下降至10．23%，且花粉管短;與散粉36、48 和60 h 的花粉萌發(fā)率不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花始期的有效花粉萌發(fā)率在24 h 之內(nèi)。

在居群開花盛期0 －4 h 花粉萌發(fā)率逐漸升高，花粉萌發(fā)率由散粉1 h 的58．03%至4 h 的81．39%。平均花粉萌發(fā)率超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的0 －10 h，平均花粉活力為51．74%。散粉24 h 后的萌發(fā)率下降至11．63%，且花粉管短;與散粉36、48 和60 h 的花粉萌發(fā)率不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花盛期的有效花粉萌發(fā)率在24 h 之內(nèi)。

表2 不同濃度蔗糖和硼酸處理下的花粉萌發(fā)率Table 2 Pollen germination percentage under different concentrations of sucrose and boric acid treatment %

表3 花粉萌發(fā)正交試驗(yàn)中培養(yǎng)基成分互作作用的方差分析Table 3 Analysis of variance of the results of the orthogonal test of germination percentage

圖1 二倍體棱葉蒜花粉活性的變化特征Fig．1 The variation characteristics of A． caeruleum pollen activity

表4 離體萌發(fā)法測定棱葉蒜花粉萌發(fā)率Table 4 Pollen germination percentage determined in vitro %

在居群開花末期0 －4 h 花粉萌發(fā)率逐漸升高，花粉萌發(fā)率由散粉1 h 的55．25%至4 h 的77．94%。平均花粉萌發(fā)率超過50%的時(shí)間為花藥散粉后的0 －8 h，平均花粉活力為52．24%。散粉24 h 后的萌發(fā)率下降至12．50%，且花粉管短;與散粉36、48 和60 h 的花粉萌發(fā)率不存在顯著差異(P ＞0．05)，由此可知，二倍體棱葉蒜開花末期的有效花粉萌發(fā)率在24 h 之內(nèi)。

2．5 花粉活力和花粉萌發(fā)率的相關(guān)性

通過對不同開花物候期的花粉活力與花粉萌發(fā)率之間的相關(guān)性分析可知，開花始期的花粉活力與萌發(fā)率之間相關(guān)系數(shù)為0．986(P ＜0．01)，開花盛期的花粉活力與萌發(fā)率之間相關(guān)系數(shù)為0．988(P ＜0．01)，開花末期的花粉活力與萌發(fā)率之間相關(guān)系數(shù)為0．997(P ＜0．01)，不同開花物候期的花粉活力與花粉萌發(fā)率之間存在極顯著正相關(guān)(P ＜0．01)。MTT 檢測法與離體萌發(fā)法均能較好地檢測花粉活性。

3 討論與結(jié)論

花粉生活力是雜交育種前評估花粉活性的一個(gè)重要手段，花粉活力測定結(jié)果的準(zhǔn)確性往往決定了細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)和雜交育種的成敗。不同植物花粉的自然壽命不同，花粉生活力檢測方法存在差異［14-16］。利用染色法進(jìn)行花粉生活力的測定，具有快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，但不同植物種類的花粉有其自身結(jié)構(gòu)特性和花粉內(nèi)含物不同等原因，不同植物的花粉選擇不同的染色方法［15］，有醋酸洋紅法［9］、TTC 染色法或I2-KI 染色法［15］、次甲基藍(lán)或聯(lián)苯胺α－萘酚染色法等［16］。

本研究表明，二倍體棱葉蒜具有較強(qiáng)的花粉活力檢測方法的選擇性，供試的7 種花粉活力檢測方法中僅有MTT 法適用于二倍體棱葉蒜花粉活力的測定，這與蔥屬植物中高葶韭(A． obliquum)的檢測結(jié)果存在差異，高葶韭花粉檢測的適合方法有TTC 染色法、MTT 染色法和聯(lián)苯胺染色法［9］，這可能與花粉孢壁的厚度、氧化還原酶活性強(qiáng)弱、花粉內(nèi)含物物質(zhì)種類和含量、花粉細(xì)胞原生質(zhì)膜透性等有關(guān)［16］。目前，適用于大多數(shù)植物花粉生活力檢測法仍然是離體萌發(fā)法［17］，該方法同樣適用于二倍體棱葉蒜，本研究表明，其最適配方為100 g·L－1的蔗糖+80 mg·L－1的硼酸，這與高葶韭花粉最適培養(yǎng)基配方100 g·L－1蔗糖+50 mg·L－1硼酸的研究結(jié)果類似［9］。

由MTT 法和離體萌發(fā)法檢測的花粉生活力結(jié)果可知，相同開花物候期和散粉時(shí)間的花粉活力多數(shù)高于花粉萌發(fā)率，說明能被染色的二倍體棱葉蒜花粉只是具有萌發(fā)的潛力，但在實(shí)際培養(yǎng)條件下不一定都能萌發(fā)。這一結(jié)果在二倍體香蕉(Musa nanalour)［17］、蘋果(Malus pumila)［18］和大花三色堇(Viola wittrockiana)［19］中也有報(bào)道。MTT 染色法與花粉線粒體中的琥珀酸脫氫酶活性有關(guān)，能夠影響二倍體棱葉蒜花粉中琥珀酸脫氫酶活性的環(huán)境因子在某種程度上會(huì)影響花粉萌發(fā)，同時(shí)，蔗糖濃度、硼離子濃度以及溫度和pH值等因子都會(huì)影響花粉萌發(fā)，共同決定了花粉活力和壽命，這為進(jìn)一步在人工控制條件下延長二倍體棱葉蒜花粉活力提供了參考。

雜交育種過程中要充分考慮開花物候期和采用的花粉育性的檢測方法。綜合各開花物候期花粉活力變化特征，分布于雅瑪里克山的二倍體棱葉蒜居群超過50%的花粉活力和花粉萌發(fā)率的時(shí)間在8 h 以內(nèi)。通過MTT 法檢測的棱葉蒜的有效花粉活力的時(shí)間在開花盛期具有48 h，長于開花始期和開花末期的36 h，而離體萌發(fā)法檢測出維持正常的花粉萌發(fā)率在不同開花物候期均表現(xiàn)出24 h，綜合比較兩種測定方法，為獲得田間雜交成功，建議授粉時(shí)間應(yīng)控制在花藥散粉后0～8 h，最佳授粉時(shí)間選擇0 ～4 h，花粉離體保存時(shí)間不超過24 h。

花粉活力與萌發(fā)率的相關(guān)性分析表明，雅瑪里克山居群的二倍體棱葉蒜同一花期的花粉活力與萌發(fā)率極顯著相關(guān)，花粉活力與花粉萌發(fā)率變化趨勢相同，都存在兩個(gè)峰值，這可能是為了適應(yīng)環(huán)境的變化，增加授粉成功機(jī)率的一種自我保護(hù)機(jī)制。

植物的花粉活力由遺傳基因決定，不同植物種類的花粉活力存在顯著差異［20］，長壽命花粉的植物在開花前、整個(gè)花期至單花花期結(jié)束時(shí)花粉均具有活力［10，21］，短壽命的花粉活力約幾小時(shí)不等［13，22-23］，二倍體棱葉蒜花粉壽命在60 h 以內(nèi)，花剛一開放花粉就已具有較高的活力，花藥散粉后的1 ～6 h 的花粉活力或萌發(fā)率維持在50%左右;且存在兩個(gè)活力高峰，48 h后基本無活力或萌發(fā)率，屬于短壽命花粉。這與野生蔥屬植物中的高葶韭［9］、蒙古韭(A． mongolicum)、堿韭(A． polyrhizum)和細(xì)葉韭(A． temuissimum)［10］的研究結(jié)果一致，高葶韭花粉高于50%的活力或萌發(fā)率只能維持2 ～10 h，48 h 后失去活力［9］;蒙古韭、堿韭和細(xì)葉韭的花粉活力在剛開花時(shí)較強(qiáng)，但下降較快，8 h后花粉基本失去活力［10］，花粉均可育，也屬于短壽命花粉。本研究通過對雅瑪里克山分布的野生二倍體棱葉蒜居群的不同開花物候期的花粉活力和萌發(fā)率測定為今后該資源的種質(zhì)創(chuàng)新奠定了理論基礎(chǔ)。

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