丁西朋,張 龍,羅小燕,嚴(yán)琳玲,劉國(guó)道,白昌軍
(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海南 儋州571737)
隨著育種業(yè)和種子貿(mào)易的發(fā)展,植物新品種權(quán)作為知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種形式,其重要性越來(lái)越突出。DUS測(cè)試,即特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)測(cè)試,是植物新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[1]。建立和完善DUS 測(cè)試技術(shù)體系,對(duì)于植物新品種權(quán)保護(hù)的發(fā)展有重要作用和現(xiàn)實(shí)意義。標(biāo)準(zhǔn)品種是植物新品種DUS 測(cè)試中對(duì)品種性狀尤其是數(shù)量性狀進(jìn)行客觀描述的參照品種,是DUS測(cè)試技術(shù)體系的重要組成部分,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品種完整的形態(tài)性狀及指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)是開(kāi)展植物品種DUS 測(cè)試的必備數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[2]。
傳統(tǒng)的DUS 測(cè)試主要以植物的表觀形態(tài)特征為基礎(chǔ),測(cè)試結(jié)果受環(huán)境影響大、穩(wěn)定性差、測(cè)試周期長(zhǎng),嚴(yán)重地阻礙了我國(guó)植物新品種授權(quán)速度[3]。因此,植物新品種DUS 快速測(cè)試技術(shù)的研究和建立十分緊迫。以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA 指紋技術(shù)具有測(cè)試周期短、不受環(huán)境影響、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì),是DUS 快速測(cè)試技術(shù)的發(fā)展方向[4]。SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是植物新品種DUS 測(cè)試中較理想的標(biāo)記技術(shù),已經(jīng)成功應(yīng)用于棉花(Gossypium hirsutum)[5]、油菜(Brassica napus)[6]、大麥(Hordeum valgure)[7]、西 瓜(Citrullus lanatus)[8]、玉 米(Zea mays)[9]、水稻(Oryza sativa)[10]、小麥(Triticum aestivum)[11]和番茄(Lycopersicon esculentum)[11]等多種農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)品種的指紋圖譜構(gòu)建及DUS 測(cè)試中。
柱花草(Stylosanthes)為多年生豆科植物,具有適應(yīng)性廣、耐干旱、耐酸瘠土、抗病性強(qiáng)、飼草產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn),是世界上熱帶及亞熱帶地區(qū)最重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草[12]。我國(guó)于1957 年開(kāi)始從國(guó)外引進(jìn)柱花草進(jìn)行栽培,先后培育出維拉諾柱花草(S. hamata cv. Verano)、熱 研2 號(hào) 柱 花 草(S.guianensis cv. Reyan No. 2)、熱引18 號(hào) 柱花草(S.guianensis cv. Reyin No. 18)、熱研20 號(hào)柱花草(S.guianensis cv. Reyan No. 20)等 多 個(gè) 柱 花 草 優(yōu) 良 品種[13-14]。柱花草屬于典型的自花授粉植物,且在開(kāi)花之前已經(jīng)授粉,異交率僅為1% ~2%[15-16]。柱花草屬包含約50 個(gè)種或亞種,染色體基數(shù)為10,大部分柱花草為二倍體植物(2n=20),也有部分為四倍體或六倍體(2n=40 或2n=60)植物[17]。2012 年,農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 柱花草》報(bào)批稿,指南中提出了柱花草DUS 測(cè)試的24 個(gè)必測(cè)植物學(xué)性狀。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心通過(guò)對(duì)192 份柱花草種質(zhì)的植物學(xué)性狀進(jìn)行測(cè)試,對(duì)該DUS 測(cè)試指南提出修改建議并確定了15 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種[18]。隨著柱花草品種的增多,其形態(tài)特征將會(huì)越來(lái)越復(fù)雜,使得依據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行柱花草品種鑒別越來(lái)越困難,因此,將SSR 標(biāo)記技術(shù)引入到柱花草DUS 測(cè)試中十分必要。據(jù)報(bào)道,在柱花草中可用的SSR 標(biāo)記共139 個(gè),分別來(lái)自柱花草屬的不同種,其中44 個(gè)來(lái)自圭亞那柱花草(S. guianensis)、26 個(gè)來(lái)自大頭柱花草(S. macrocephala)、23 個(gè)來(lái)自灌木柱花草(S. seabrana)、23 個(gè)來(lái)自頭狀柱花草(S. capitata),其余來(lái)自其他14 個(gè)不同的柱花草種[19-24]。熱帶牧草中心熱帶牧草研究中心對(duì)其中123 個(gè)SSR 標(biāo)記在8 個(gè)柱花草種間的轉(zhuǎn)移性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,44 個(gè)在8 種柱花草中都能有效擴(kuò)增,其中26 個(gè)多態(tài)性較好[25]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,利用25 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)15 個(gè)柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,構(gòu)建15 份標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA 指紋圖譜QR 二維碼數(shù)據(jù)庫(kù),以期為SSR 標(biāo)記技術(shù)在柱花草DUS 測(cè)試中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
試驗(yàn)材料除了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南柱花草》中列出的圭亞那柱花草、有鉤柱花草(S. hamata)、糙柱花草(S. scabra)、頭狀柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種外,還包括熱帶牧草中心對(duì)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 柱花草》驗(yàn)證后建議新增的圭亞那柱花草、大頭柱花草、馬弓形柱花草(S. hippocampoides)、矮柱花草(S. humilis)以及細(xì)莖柱花草(S. gracilis)等其他標(biāo)準(zhǔn)品種[18],共計(jì)15 份柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種(表1),均種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心基地,每個(gè)小區(qū)面積為24 m2,株距為80 cm,行距為100 cm,走道為1.5 m,四周設(shè)置保護(hù)行,每小區(qū)種植總株數(shù)為42。
表1 15 份柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種Table 1 15 Stylosanthes standard cultivars for DUS testing
將去皮的柱花草種子在80 ℃水中浸泡5 min,然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽,發(fā)芽后移至14 L 塑料盆中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)1 個(gè)月后,每份標(biāo)準(zhǔn)品種隨機(jī)挑選5 株,對(duì)葉片進(jìn)行混合取樣,置于液氮中保存。按照筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用的改良CTAB 法提取柱花草總DNA[25],并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品。SSR 標(biāo)記選用筆者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選過(guò)在8個(gè)不同柱花草中多態(tài)性較好的25 個(gè)標(biāo)記(表2)[25],均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系為20 μL 體系:1 μL 50 ng·μL-1模板,0.8 μL 5 μmol·μL-1上下游混合引物,0. 3 μL 10 μmol·μL-1dNTPs,2 μL 10 × PCR Buffer,0.2 μL 5 U·μL-1Taq聚合酶,ddH2O 補(bǔ)足。PCR 程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。8%聚丙烯酰胺凝膠(8 mL 30%丙烯酰胺/N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺=29/1、300 μL 10%過(guò)硫酸銨、30 μL TEMED、3 mL 10 × TBE、18.7 mL H2O)電泳,銀染檢測(cè)。
根據(jù)每對(duì)SSR 引物對(duì)每份材料的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在Excel 表格中進(jìn)行統(tǒng)計(jì),位點(diǎn)由大到小依次記錄,同一位點(diǎn)處,有擴(kuò)增條帶的記為“1”,沒(méi)有擴(kuò)增的就記為“0”。用NTSYS-pc 2.10e 軟件進(jìn)行非加權(quán)組平均(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means,UPGMA)聚類分析,其中Qualitative data 計(jì)算遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS)[26],并利用FreeTree 軟件[27]通過(guò)1 000 次重抽樣對(duì)聚類圖進(jìn)行bootstrap 分析。利用POPGEN 1.32軟件分析每對(duì)SSR 引物等位基因頻率(Allele Frequency)、等位基因數(shù)(Number of Alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Effective Number of Alleles,Ne)、Shannonx 信息指數(shù)(Shannon’s Information Index,I)及Nei’s 多樣性指數(shù)(Nei’s Gene Diversity,He)[28]。根據(jù)等位基因頻率計(jì)算每個(gè)SSR 標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(Ploymorphism Information Content,PIC),其計(jì)算公式為:
式中,n 表示每個(gè)SSR 標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)目,Pi、Pj表示第i、j 個(gè)等位基因在供試材料中出現(xiàn)的頻率[29]。
表2 所選25 個(gè)SSR 標(biāo)記信息Table 2 The information of 25 SSR markers used in this study
DNA 指紋圖譜構(gòu)建參照范建光等[8]、宋海斌等[30]圖譜代碼構(gòu)建的方法,采用英文字母與數(shù)字組合的方式,其中英文字母按照已篩選出的核心引物字母編號(hào)(A、B、C、…)依次排列(表2),組成的數(shù)字則表示各個(gè)引物在不同標(biāo)準(zhǔn)品種中對(duì)應(yīng)的基因型(將SSR 引物在所有標(biāo)準(zhǔn)品種中的PCR 產(chǎn)物按照分子量由大到小依次排列,用其數(shù)字順序表示對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品種的基因型)。如西卡柱花草部分指紋圖譜QR編碼為A2B6,A2 表示SSR4 引物在西卡柱花草中的基因型為2(SSR4 引物在西卡柱花草中PCR 產(chǎn)物的分子量是所有標(biāo)準(zhǔn)品種中第二大),B6 表示SSR5 引物在西卡柱花草中的基因型為6(SSR5 引物在西卡柱花草中PCR 產(chǎn)物的分子量居所有標(biāo)準(zhǔn)品種中第六大)。利用25 個(gè)SSR 標(biāo)記在西卡柱花草的基因型,最終形成西卡柱花草DNA指紋圖譜的QR編碼為A2B6C4D1E6F2G4 H1I3J2K3L9M2N1O1P1Q2R3S7T2U5V3W3X1Y1,將 15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種的QR 編碼利用廈門(mén)聯(lián)圖網(wǎng)絡(luò)科技有限公司開(kāi)發(fā)的在線二維碼生成軟件(http://www. liantu.com/shiliang/)生成對(duì)應(yīng)的矢量二維碼,并作圖。
利用POPGEN 1.32 軟件對(duì)分析25 個(gè)SSR 標(biāo)記在15 個(gè)柱花草標(biāo)DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種中的遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了分析(表2),結(jié)果顯示,25 個(gè)SSR 標(biāo)記在15 個(gè)柱花草標(biāo)準(zhǔn)中均具有多態(tài)性,共產(chǎn)生132 個(gè)等位基因,每個(gè)標(biāo)記產(chǎn)生3 ~9 個(gè)等位基因,平均產(chǎn)生5.280 個(gè);每個(gè)標(biāo)記的有效等位基因數(shù)為1.751 ~7.258個(gè),平均3.498 個(gè);每個(gè)標(biāo)記的Nei’s多樣性指數(shù)為0.429 ~0.862,平均0.680;各SSR 標(biāo)記的Shannonx 信息指數(shù)為0.820 ~2.084,平均1.368;另外,各SSR 標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC)平均為0.638,變化范圍為0.393 ~0.847,其中SSR58 的PIC 值最低,為0.393,SSR35 的PIC 值最高,為0.847,25 對(duì)SSR 引物的多態(tài)性信息含量主要集中在0.600 ~0.800,表明本研究中SSR 標(biāo)記表現(xiàn)出較高多態(tài)性。
采用NTSYS-pc 2.10e 軟件中的非加權(quán)組平均法(UPGMA),對(duì)15 個(gè)柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行聚類分析(圖1),品種間的遺傳相似系數(shù)介于0.500 ~0.992,平均值為0.714,聚類分析結(jié)果顯示柱花草不同品種間的變異較大。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.570 時(shí),可將15 個(gè)柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種分為兩個(gè)類群,其中第1 個(gè)類群主要包含西卡柱花草、有鉤柱花草、矮柱花草、頭狀柱花草及大頭柱花草,而第2 個(gè)類群主要為圭亞那柱花草,另外還包括馬弓形柱花草和細(xì)莖柱花草。在第1 個(gè)類群中,西卡柱花草、有鉤柱花草及矮柱花草的遺傳距離更為接近,頭狀柱花草和大頭柱花草同樣能劃分為1 個(gè)亞群;第2 類群中,圭亞那柱花草Tardio 與馬弓形柱花草和細(xì)莖柱花草可聚為同一亞類。
利用SSR 標(biāo)記對(duì)15 份柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行聚類分析的結(jié)果(圖1)與熱帶牧草中心前期對(duì)192 份柱花草種質(zhì)資源聚類分析時(shí)的結(jié)果一致,依照DUS 測(cè)試指南中測(cè)試性狀進(jìn)行聚類分析后也可將不同種質(zhì)資源劃分為兩個(gè)大的類群,其中第1 個(gè)類群以灌木型柱花草為主,第2 個(gè)類群主要是草本型柱花草[18]。性狀測(cè)試與分子標(biāo)記的聚類分析結(jié)果一致,表明利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜作為柱花草品種評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)具有可行性。
本研究中不僅運(yùn)用25 對(duì)核心SSR 引物建立了15 個(gè)柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種的指紋圖譜(表3),還依據(jù)DNA 指紋圖譜組成QR 編碼,通過(guò)在線二維碼生成軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行二維編碼(圖2),最終構(gòu)建成15 份柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種DNA 指紋圖譜的QR 二維碼數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)所包含的主要信息:編號(hào)為該標(biāo)準(zhǔn)品種在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物資源品種研究所熱帶牧草研究中心柱花草種質(zhì)資源的系統(tǒng)編號(hào),材料名稱為標(biāo)準(zhǔn)品種名稱,DNA 指紋圖譜為25 對(duì)核心SSR 引物及其對(duì)應(yīng)的基因型編號(hào),如編號(hào)為2 的柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種,其材料名稱為西卡 柱 花 草, 對(duì) 應(yīng) 的DNA指紋圖譜為A2B6C4D1E6F2G4H1I3J2K3L9 M2 N1 O1 P1 Q2 R3 S7 T2 U5 V3 W3 X1 Y1。而DNA指紋圖譜QR 編碼生成二維碼在今后的育種工作中能夠更方便更準(zhǔn)確地通過(guò)掃描二維碼獲得該品種的相關(guān)信息,這樣為實(shí)現(xiàn)柱花草品種鑒定的自動(dòng)化和信息化提供基礎(chǔ),為今后品種鑒別和育種等工作提供直接證據(jù)。
隨著作物種質(zhì)資源的不斷挖掘,育種材料背景日益狹窄,僅僅依靠目前傳統(tǒng)的DUS 測(cè)試技術(shù)以植物學(xué)性狀進(jìn)行品種鑒別的方法是不可取的。一方面,植物學(xué)性狀受環(huán)境影響較大,影響DUS 測(cè)試的準(zhǔn)確性,且觀測(cè)周期長(zhǎng),一般需要2 ~3 年的田間重復(fù)試驗(yàn);另一方面,標(biāo)準(zhǔn)品種存在不穩(wěn)定的因素,相近品種依據(jù)植物學(xué)性狀分辨困難[3]。因此,基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)正在成為植物新品種DUS 測(cè)試的發(fā)展方向,RAPD、ISSR、AFLP 和SRAP 等分子標(biāo)記已先后被用于植物品種鑒定[4]。這些標(biāo)記均是采用無(wú)基因組序列信息的標(biāo)記技術(shù),盡管有一定的實(shí)用性,但標(biāo)記隨機(jī)性強(qiáng)、穩(wěn)定差[17]。SSR 技術(shù)具有共顯性、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),被《植物品種鑒定DNA 指紋方法 總則》NY/T2594 -2014 推薦為當(dāng)前各植物品種DNA 指紋鑒定的主要標(biāo)記方法。
圖1 柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種聚類分析Fig.1 Clustering analysis of Stylosanthes sample cultivars based on SSR markers
目前,SSR 標(biāo)記在柱花草中主要應(yīng)用于遺傳多樣性分析與核心種質(zhì)的構(gòu)建。Chandra 等[17]利用BAC 文庫(kù)和EST序列開(kāi)發(fā)了41 個(gè)SSR 標(biāo)記,并利用這些SSR 標(biāo)記對(duì)20 份灌木柱花草種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Santos-Garcia等[31]利用20 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)150 個(gè)圭亞那柱花草種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析,將其分為9 類。Santos-Garcia 等[32]利用SSR 標(biāo)記對(duì)134 份大頭柱花草種質(zhì)和192 份頭狀柱花草種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析,最終確定了分別含有23 份大頭柱花草和13 份頭狀柱花草的核心種質(zhì)。
本研究用25 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)15 份柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到132 個(gè)等位基因,每個(gè)標(biāo)記可檢測(cè)到3 ~9 個(gè)等位基因,平均為5. 280 個(gè);每個(gè)SSR 標(biāo)記的多態(tài)性信息含量為0.393 ~0.847,平均為0.638,說(shuō)明SSR 標(biāo)記具有較高的遺傳多態(tài)性。本研究中聚類分析表明,25 個(gè)SSR 標(biāo)記能有效地將15 份柱花草DUS 標(biāo)準(zhǔn)品種分為兩大類,該聚類結(jié)果與用其他分子標(biāo)記分析的結(jié)果相一致[33-35]。
表3 柱花草標(biāo)準(zhǔn)品種DNA 指紋圖譜Table 3 The DNA fingerprinting of Stylosanthes sample cultivars
圖2 柱花草DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種DNA 指紋圖譜QR 編碼Fig. 2 The DNA fingerprinting QR codes of Stylosanthes example cultivars in DUS test
DNA 指紋圖譜的構(gòu)建方法也有多種,包括巫桂芬等[36]利用標(biāo)記多態(tài)性產(chǎn)生的等位變異構(gòu)建法,劉娟等[37]運(yùn)用Gel 2.0 軟件對(duì)特征引物擴(kuò)增的凝膠帶譜構(gòu)建指紋模式圖譜,楊青松等[38]利用特征引物組合構(gòu)建個(gè)體特異的DNA 指紋圖譜法以及本研究參考的范建光等[8]、宋海斌等[30]圖譜代碼構(gòu)建法形成DNA 指紋圖譜的QR 編碼生成二維碼等,相比之下指紋圖譜QR編碼構(gòu)建法包含信息量豐富,準(zhǔn)確可靠,并且在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用簡(jiǎn)便。
由于柱花草遺傳學(xué)背景研究較少,已報(bào)道的SSR標(biāo)記數(shù)目有限,本研究選取的25 個(gè)SSR 標(biāo)記可能不能夠很好的反映不同柱花草種質(zhì)資源間的遺傳差異,今后應(yīng)開(kāi)發(fā)更多的SSR 標(biāo)記,并將多態(tài)性高、條帶清晰的SSR 標(biāo)記加入到已構(gòu)建好的指紋圖譜庫(kù)中,以更好地將SSR 標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于柱花草的DUS 測(cè)試和新品種鑒定。
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