楊春雪，陳 飛，岳英男，閻秀峰

(1．東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱150040;2．東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150040)

土壤鹽漬化是世界各國面臨的共同難題，我國鹽堿土面積已超過了370 萬hm2，且正以每年1．4%的速度擴展［1］，松嫩平原地處半濕潤半干旱過渡帶，因溶解在水中的鹽分容易在土壤表層積聚，鹽堿地主要成分是蘇打鹽，草甸土和鹽堿常呈復合體形式分布［2-3］?，F(xiàn)今，針對草地大面積鹽堿化、退化等問題，我國各級部門先后采取過以稻治堿、以水治堿等治理措施，盡管投入了大量資金，但土壤鹽堿化始終沒有得到治理。因此，借助其他技術手段加以輔助和治理恢復草原生態(tài)系統(tǒng)就顯得尤為重要。

叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae，AM)真菌是土壤中廣泛存在的一類共生真菌，能與90%以上的高等植物形成叢枝菌根［4］。植物長期生活在高鹽條件下會出現(xiàn)營養(yǎng)虧缺、離子毒害及氧化脅迫等癥狀［5］，AM 真菌能活化土壤，調(diào)節(jié)植物滲透平衡，增強植物對礦質(zhì)元素和水分的吸收，提高光合作用，促進生物量的積累，提高植物的耐鹽能力［6-7］。本研究探究松嫩鹽堿草地中AM 真菌的資源分布和多樣性，分析土壤因子與AM 真菌生態(tài)分布和多樣性之間的關系，以期為篩選高效AM 真菌菌種資源，促進AM 真菌在鹽堿土改良中的應用提供參考。

1 材料與方法

1．1 樣品采集

本研究于2013 年7 月在黑龍江省肇東市周邊松嫩鹽堿草地采集了共11 科26 種耐鹽植物根際土壤，樣點分布見表1。根據(jù)“多點平行取樣法”和“五點取樣法”［8］按照東南西北4 個方向隨機對26 種植物取樣，重復3 次，用小鏟輕輕刮去地表的雜物，向下垂直挖取12 ～20 cm 深的植物根圍土壤，并保留粘附在植物根系表面的細土，最后經(jīng)“四分法”［8］保留1 kg 土樣，統(tǒng)一編號后帶回，并記錄采集時間、地點和周圍環(huán)境。

1．2 AM 真菌的分離和鑒定

采集的土壤樣品自然風干，每次稱取土樣100 g，利用濕篩傾析－蔗糖離心法分離AM 真菌孢子［9］，于實體顯微鏡下統(tǒng)計孢子密度、物種豐度和Shannon-Weiner 指數(shù)(H);輕挑孢子于載玻片上，分別用水、乳酸、PVLG、Melzer’s 試劑為浮載劑制片，在OLYMPUS CX21 生物顯微鏡下觀察孢子的顏色、紋飾、連孢菌絲等特征，測量孢子大小、菌絲壁厚度、菌絲寬度，拍照并記錄。參照“VA 菌根鑒定手冊”［10］和國際AM 真菌菌種保藏中心(International Collection Center of Vesicular and Arberscular Mycorrhizal Fungi，INVAM)提供的AM真菌種屬描述以及Internet(http://invam． caf． wvu．edu)上提供的圖片，并參閱近幾年發(fā)表的有關AM 真菌分類的相關資料和原始文獻對AM 真菌進行形態(tài)鑒定。

1．3 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤理化性質(zhì)參照《土壤農(nóng)化分析》［11］和中國科學院南京土壤研究所的方法測定［12］。土壤pH 值采用玻璃電極法，用雷磁PHSJ-4A 測定;土壤全鹽量采用浸出液電導率法，用雷磁DDSJ-308A 測定;土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀-濃硫酸法，用數(shù)顯JXX1-HH-8 油浴鍋測定;土壤全氮量采用半微量凱氏法，用ATN-1100 全自動凱氏定氮儀測定;土壤全磷量采用硫酸-高氯酸消煮法測定;土壤全鉀量采用NaOH 熔融－火焰光度計法測定(上海，F(xiàn)P6450 型火焰光度計)。

1．4 AM 真菌的多樣性測定

參考張美慶等［13］和秦燕燕等［14］的方法計算AM真菌孢子密度(Spore Density，SD)、物種豐度(Species Richness，SR)、分 離 頻 度(Frequency，F(xiàn))、相對多度(RelativeAbundance，RA)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)和重要值(Importance Value，IV)。

表1 松嫩鹽堿草地26 種植物分布情況Table 1 The distribution situation of 26 plants in Songnen saline-alkaline grassland

SD=AM 真菌所有種的孢子數(shù)/土壤樣本數(shù);

SR=AM 真菌總種數(shù)目/土壤樣本數(shù);

F = AM 真菌某菌種出現(xiàn)的次數(shù)/總樣本數(shù)×100%;

RA=AM 真菌某菌種的孢子數(shù)/AM 真菌總孢子數(shù)×100%。

利用Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H)來描述AM真菌的物種多樣性，H=Piln Pi，利用重要值［IV=(F+RA)/2 ×100%］將AM 真菌優(yōu)勢度等級劃分為優(yōu)勢屬(種)、最常見屬(種)、常見屬(種)和稀有屬(種)4 個等級，相應的IV 值分別為:IV ＞50%、30% ＜IV≤50%、10% ＜IV≤30%和IV≤10%。

1．5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17．0 對AM 真菌土壤理化性質(zhì)和多樣性指標進行單因素方差分析(Duncans)和多重比較(α=0．05)，用平均值和標準誤表示測定結果;分析土壤因子與AM 真菌之間的相關性;采用Microsoft Excel 對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖。

2 結果

2．1 土壤理化性質(zhì)

松嫩鹽堿草地26 種植物根際土壤的pH 值和全鹽量相差不大(表2)，pH 最高的植物為堿蓼，達到了8．96，最低的為蒲公英，僅為7．40;土壤全鹽量平均為0．22%，這表明松嫩鹽堿草地屬于中鹽度土質(zhì)。各植物根際土壤的有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量差異明顯，26 種植物根際土壤的有機質(zhì)含量平均值為22．03 g·kg－1，全氮量平均值為1．57 g·kg－1，全磷量平均值為0．63 g·kg－1，全鉀量平均值為22．12 g·kg－1。26 種植物中，土壤的有機質(zhì)含量、全氮量、全磷量的最高值均出現(xiàn)在蒲公英根際，分別為24．32、1．72 和0．73 g·kg－1，黃芪根際土壤的全鉀含量達所有植物中的最高值，為24．66 g·kg－1;扁蓄蓼的有機質(zhì)含量、全氮量、全磷量和全鉀量均達到所有植物中的最低值，分別為19．06、1．38、0．45 和15．03 g·kg－1。

2．2 AM 真菌種類及資源分布

從26 種植物根圍共分離出AM 真菌5 屬40 種(表3、圖1)，已鑒定38 種，尚有兩個未確定種(sp1 和sp2)。其中球囊霉屬(Glomus)21 種，占總種數(shù)的52．5%;無梗囊霉屬(Acaulospora)12 種，占總種數(shù)的30%;盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)4 種，占總種數(shù)的10%;巨孢囊霉屬(Gigaspora)兩種，占總種數(shù)的5%;和平囊霉屬(Pacispora)只有玻利維亞和平囊霉(Pacispora boliviana)1 種。根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)和地表球囊霉(G． versiforme)廣泛分布在植物根圍土壤中，二者是研究地區(qū)的常見菌種;極大巨孢囊霉(Gigaspora gigantea)、圓齒盾巨孢球囊霉(Scutellospora crenulata)和亮色盾巨孢球囊霉(S． fulgida)均只在一種植物根際土中出現(xiàn)，是該地區(qū)的稀有菌種。

2．3 AM 真菌的孢子密度、物種豐度和多樣性指數(shù)

26 種植物根際土壤中均有不同程度的AM 真菌孢子存在(表4)。蒲公英的物種豐度和Shannon-Weiner 指數(shù)均達到所有植物中的最高值，分別為15．81 和1．43;蓼科植物AM 真菌資源分布少，Shannon-Weiner 指數(shù)低，其中扁蓄蓼孢子密度、物種豐度和Shannon-Weiner 指數(shù)均為所有植物中的最低值，僅有452．3 cfu·kg－1、9．92 和0．38。

2．4 AM 真菌分離頻度、相對多度和重要值

試驗結果表明，球囊霉屬的分離頻率、相對多度和重要值在26 種植物中較高，是優(yōu)勢屬;無梗囊霉屬為常見屬，巨孢囊霉屬的重要值僅有3．01%，是研究地的稀有屬。根內(nèi)球囊霉的分離頻度、相對多度和重要值分別為80．77%、6．47%和43．62%，是該研究區(qū)的優(yōu)勢菌種，地表球囊霉僅次于根內(nèi)球囊霉，是常見菌種，這表明二者對鹽堿環(huán)境有較強的耐受力。極大巨孢囊霉、圓齒盾巨孢球囊霉和亮色盾巨孢球囊霉的重要值在26 種植物中均相對偏低，是研究區(qū)的稀有種(表5)。

2．5 土壤因子與AM 真菌的相關性

試驗結果表明，土壤各因子與AM 真菌多樣性密切相關(表6)，土壤營養(yǎng)因子對AM 真菌的影響要強于鹽度因子，其中pH 值與孢子密度和物種豐度之間表現(xiàn)出顯著負相關(P ＜0．05)，而全鹽量與AM 真菌的孢子密度、物種豐度和多樣性指數(shù)均沒有顯著相關性(P ＞0．05);土壤營養(yǎng)因子中，有機質(zhì)和全氮量對AM 的影響最大，其中有機質(zhì)和全氮量與孢子密度、物種豐度呈極顯著正相關(P ＜0．01)，與多樣性指數(shù)呈顯著正相關(P ＜0．05);全磷量與孢子密度、物種豐度和多樣性指數(shù)均表現(xiàn)出顯著相關(P ＜0．05)，而全鉀量與孢子密度、物種豐度和多樣性指數(shù)之間沒有顯著相關性(P ＞0．05)。

3 討論與結論

3．1 AM 真菌的多樣性和分布

植物根圍AM 真菌多樣性指標反映了宿主植物與AM 真菌之間的親和力，從采集的26 種常見鹽堿植物根圍中共分離鑒定出AM 真菌5 屬38 種及兩個未確定種，說明松嫩鹽堿草地具有豐富的AM 真菌資源，這與張義飛［15］、周偉?。?6］等對松嫩平原西部地區(qū)AM真菌資源分布的研究結果相似。26 種鹽堿植物均能與AM 真菌形成良好的共生體系，但不同植物根際土壤的孢子種類、孢子密度、物種豐度、多樣性指數(shù)、分離頻度、相對多度和重要值均有明顯差異，這說明AM 真菌與宿主植物形成共生體系時存在一定的偏好性，AM真菌與宿主植物間的親和程度及二者的相互選擇性在一定程度上決定了AM 真菌的生存和發(fā)育，這可能與不同植物根細胞對營養(yǎng)成分的種類和需求量不盡相同有關［17］。Tawaraya 等［18］發(fā)現(xiàn)，宿主植物種類和根系結構特征是AM 真菌共生與繁殖的重要因素，宿主植物不同，AM真菌種類、多樣性也隨之變化。

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表3 26 種植物根際土壤AM 真菌資源及地區(qū)分布Table 3 The resources and distribution of AM fungi in rhizosphere of the twenty six plants

續(xù)表3

圖1 本研究分離的5 屬40 種AM 真菌Fig．1 40 AM fungi species of five genus isolated in this study

續(xù)圖1 本研究分離的5 屬40 種AM 真菌Continued Fig．1 40 AM fungi species of five genus isolated in this study

26 種鹽堿植物根際土壤AM 真菌孢子的分離頻度、相對多度和重要值總體上的趨勢表現(xiàn)為球囊霉屬＞無梗囊霉屬＞盾巨孢囊霉屬＞巨孢囊霉屬＞和平囊霉屬，其中球囊霉屬和無梗囊霉屬在不同植物中均占絕對優(yōu)勢，這個研究結果與球囊霉屬和無梗囊霉屬是廣譜共生系統(tǒng)真菌的觀點符合［19］。Joniper 和Abbott［20］發(fā)現(xiàn)，不同AM 真菌對鹽脅迫的耐受力不同，鹽堿對根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉的影響較小，但對美麗盾巨孢囊霉和光壁無梗囊霉孢子的萌發(fā)及芽管伸長有一定程度的抑制［20］。根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉是研究區(qū)共同的優(yōu)勢菌種，細凹無梗囊霉和集球囊霉在松嫩鹽堿草地分布較多，是植物根際土中常見菌種，表明這幾種AM 真菌對鹽堿環(huán)境的適應力相對較強，同時與26 種植物均表現(xiàn)出較好的親和力，可作為松嫩鹽堿草地篩選優(yōu)勢菌種的依據(jù)。

3．2 土壤因子與AM 真菌多樣性的關系

Christopher 等［21］研究證實，土壤因子通過作用于宿主植物從而間接影響AM 真菌的生長、繁殖及生態(tài)分布。從表6 可知，孢子密度和物種豐度與土壤有機質(zhì)和全氮量均表現(xiàn)為極顯著正相關(P ＜0．01)，與全磷量表現(xiàn)為顯著性正相關(P ＜0．05)。這是因為AM真菌能促進宿主植物對土壤中NH4+、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨基酸的吸收，通過菌絲網(wǎng)的進一步過濾，參與植物氮素代謝;菌根吸收NH4+后，釋放H+，使土壤pH 值降低，從而刺激根系對土壤磷元素的吸收利用［22］。研究結果表明，有機質(zhì)和全氮量表現(xiàn)出極顯著正相關(P＜0．01)，有機質(zhì)在一定范圍內(nèi)增進AM 真菌菌絲的形成和發(fā)育，但過高或過低均會抑制菌根的功能發(fā)揮［23］，在對西藏高原針茅的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤有機質(zhì)含量在20．2 ～77．4 g·kg－1時，AM 真菌多樣性表現(xiàn)為最優(yōu)［24］，故本研究認為全氮量也僅能在一定范圍內(nèi)促進AM 真菌的生長和發(fā)育，陳寧等［25］的研究證實了這一點，并提出當?shù)缀勘葹?∶ 2 時，最有利于AM真菌的生長，因為磷元素含量過高，反而會抑制菌絲的伸長和增粗，這可能是由于全磷量過高打亂了根系分泌物的平衡，使細胞膜透性受到破壞［26］。本研究結果顯示(表6)，土壤pH 值與孢子密度和物種豐度均呈現(xiàn)出顯著的負相關，與多樣性指數(shù)并無顯著相關性(P＞0．05)，這表明土壤的鹽度在一定程度上抑制了AM真菌的產(chǎn)孢能力，這與任愛天等［27］的研究結果一致。但Baker 等［28］在對惠農(nóng)鹽化灌淤土植物的研究中卻得到了相互矛盾的結果，當灌溉水NaCl 的濃度達到0．3 mol·L－1時，幾乎完全抑制了AM 真菌的生長繁殖 能 力， 而 雅 美 紫 菀(Aster tripolium)的根系卻依然有菌根侵染，所以Johnson 等［29］報道，認為AM 真菌的多樣性和土壤鹽度關系不大，主要是受土壤養(yǎng)分因子的限制，這與本研究結果一致，相比于土壤鹽度，土壤養(yǎng)分因子對AM 真菌多樣性的影響相對更大。土壤全鉀量與全鹽量對AM 真菌的多樣性均無顯著相關關系，這可能是由于鉀元素易與周圍土壤形成難溶于水的礦物質(zhì)(KAlSi3O8)，致使植物無法吸收的緣故，Ouimet 和Camiré［30］的研究也證實了這一點。

表4 26 種植物AM 真菌孢子密度、種的豐度和Shannon-Winner 多樣性指數(shù)Table 4 Spore density，species richness and Shannon-Winner diversity index of the AM fungi in 26 plant species

表5 26 種植物AM 真菌分離頻度、相對多度、重要值Table 5 Frequency，relative abundance and importance value of the AM fungi in twenty six plants %

表6 土壤特性與AM 真菌多樣性之間的相關性Table 6 The correlation between soil properties and AM fungi species diversity

本研究結果表明，在分離鑒定出的5 屬38 種AM真菌中，球囊霉屬是研究區(qū)的優(yōu)勢屬，無梗囊霉屬為常見屬，由此可見，二者對鹽堿環(huán)境有較強的耐受力;而巨孢囊霉屬和盾巨孢囊霉屬所占的比例較少，是研究區(qū)的稀有屬，這與張美慶等［19］對我國北方農(nóng)田土壤AM 真菌生態(tài)分布的研究結果相似。

從研究結果可知，肇東地區(qū)松嫩平原鹽堿植物根際土中AM 真菌資源十分豐富。根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉是不同采樣區(qū)域的共同優(yōu)勢菌種，而集球囊霉和縮球囊霉也高頻率地出現(xiàn)在不同的植物根際，這說明同一樣地同一宿主植物可以同時被多種AM 真菌侵染，不同樣地同一菌種在同一宿主植物上出現(xiàn)的頻度也可能存在差異［31］，以上研究結果為進一步探究松嫩平原AM真菌的多樣性提供了依據(jù)。

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