董斌李榮喜黃永芳洪文泓譚莎

（1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術學院，廣州 510507；2. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642）

分子標記在油茶研究中的應用

董斌1，2李榮喜1黃永芳2洪文泓2譚莎2

（1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術學院，廣州 510507；2. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642）

近年來，分子標記技術發(fā)展快速，其在油茶研究中的應用也越來越廣泛。由于分子標記具有高效、可靠等諸多優(yōu)點，它的快速發(fā)展為油茶開展遺傳多樣性分析、品種鑒定、優(yōu)良基因定位、分子輔助育種、遺傳圖譜構建等方面研究提供了一條快速有效的途徑。綜述了RAPD、AFLP、SSR、ISSR和SRAP等幾種分子標記在油茶研究中的應用，并在此基礎上分析了分子標記在油茶研究中存在的問題和今后研究工作的重點。

分子標記；油茶；遺傳多樣性；基因定位；分子輔助育種

油茶（Camellia oleifera）為山茶科山茶屬植物，與油棕（Elaeis guineensis）、油橄欖（Olea europaea）、椰子（Cocos nucifera）并稱為世界“四大木本油料植物”，是我國南方主要的木本食用油料樹種。茶油脂肪酸主要由油酸、亞油酸和少量的飽和脂肪酸組成，并含有多種功能性成分，對于維持心血管系統(tǒng)功能，提高人體免疫力，降低膽固醇，預防和治療高血壓具有明顯功效［1］。此外，油茶全身都是寶，其副產(chǎn)品在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面均具有較大經(jīng)濟價值。

我國是油茶的原產(chǎn)地，栽培歷史悠久。廣義的油茶指山茶屬（Camellia）植物中含油率較高、且有一定栽培面積的樹種，我國主要栽培有油茶、小果油茶（Camellia meiocarpa）、攸縣油茶（Camellia yuhsienensis）、浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）和騰沖紅花油茶（Camellia reticulata）等［2］。據(jù)《三農(nóng)記》清張宗法（1700年）引證《山海經(jīng)》緒書：“員木，南方油食也”。“員木”即油茶，可見我國取油茶果榨油以供食用，已有2300多年的歷史［3］。油茶經(jīng)過了長期的自然及人工選擇，形成了豐富的種質資源。近年來，科研單位不斷加大對油茶優(yōu)良品種的選育力度，一些新品種、優(yōu)良無性系不斷出現(xiàn)，隨著各地區(qū)間的引種栽培，各地區(qū)各優(yōu)良無性系間的不斷雜交，導致形態(tài)學差異越來越小，給油茶種質資源的分類研究帶來諸多不便，進一步影響了油茶的良種選育。生物技術的快速發(fā)展，尤其是分子標記的廣泛應用為進一步開展油茶種質資源鑒定及良種選育提供了極大的幫助。分子標記是利用限制性內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，再經(jīng)過特異探針雜交，通過同位素顯色技術揭示生物多樣性的方法。自從1974年Grodzicker創(chuàng)立RFLP技術以來［4］，分子標記發(fā)展迅速，包括：RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SRAP等技術不斷面世。本文對近幾年在油茶研究中使用較多的幾種分子標記進行綜述和討論，以期為該技術在油茶中的進一步研究做一些歸納性的基礎工作。

1 分子標記在油茶研究中的應用

1.1 油茶RAPD標記的應用

1990年，Williams等和Welsh等對一種較為簡便的檢測DNA多態(tài)性技術［5，6］做了報道，即隨機引物PCR（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術，它能快速、簡便而且準確地檢測DNA 的多態(tài)性。RAPD 技術與其他分子標記技術相比，其原理簡單、操作容易、成本較低，直接揭示DNA水平上的差異。但隨著分子標記技術的發(fā)展，其為顯性標記、重復性較差、擴增條帶有限、可靠性較差等缺點逐漸顯現(xiàn)［7］，更多的研究需要通過形態(tài)數(shù)據(jù)分析和其他檢測手段互相驗證［8，9］。

黃永芳等［10，11］、張云等［12］、闕生全等［13］分別提出了油茶RAPD反應體系優(yōu)化方案。陳永忠等［14］利用22個隨機引物對13個油茶優(yōu)良無性系進行RAPD分析，確定了油茶品種間存在較大差異，并以此為基礎建立油茶優(yōu)良無性系的RAPD分子鑒別體系。張云等［15］對油茶32個品系及10個龍眼茶農(nóng)家品種開展遺傳多樣性分析及性狀比較發(fā)現(xiàn)，油茶果含油率可能與RAPD標記的某些基因有連鎖關系，但各品系的單株結實量與RAPD標記間無明顯相關。陳永忠等［16］在對油茶雄性不育優(yōu)良無性系選育研究中，通過RAPD技術證明了油茶雄性不育系與普通油茶的遺傳距離較遠。譚曉風等［17］利用RAPD分子技術對山茶屬油茶組植物進行了分子分類發(fā)現(xiàn)，油茶、狹葉油茶（Camellia lanceoleosa）和越南油茶（Camellia vietnamensis）親緣關系最近，與高州油茶（Camellia gauchwensis）相對也較近，而茶梅（Camellia sasanqua）則與各種間的遺傳距離最大，結果與形態(tài)分類學一致。黃永芳等［18］利用RAPD標記技術分析了90份油茶種質的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，無性系間存在豐富的遺傳多樣性的同時，還初步定位了與抗病性、果油率和產(chǎn)油量數(shù)量性狀相關的譜帶。

總體來說，RAPD標記技術是在制作基因圖譜，植物種質資源研究，分類學研究及系統(tǒng)發(fā)育與演化的強大技術［19］，也是20世紀90年代中后期至21世紀前5年在油茶遺傳多樣性研究中應用較多的分子鑒定手段，但近年來逐步被其他分子標記技術所取代。

1.2 油茶AFLP標記的應用

擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP），是1993年由荷蘭Keygene公司的科學家Zabeau和Vos創(chuàng)建發(fā)展的一種DNA分子標記技術［21］。AFLP結合了RFLP技術和RAPD技術的優(yōu)點，具有DNA用量少，重復性好，精確度較高，多態(tài)性豐富，引物通用等優(yōu)點。同時，它屬于對基因組DNA進行分析的高通量分子標記，可以在全基因組范圍內(nèi)對多個不同的遺傳位點同時進行變異分析［22］，廣泛應用于遺傳變異及基因流動方面的研究［23］。

張婷等［24］對湖北省5個地區(qū)油茶的遺傳多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同居群間遺傳多樣性水平相差較大，油茶遺傳分化主要存在于居群內(nèi)，油茶群體存在相對隔離的情況。金龍等［25］對安徽油茶基地23個健康植株進行AFLP分析，再次印證了油茶具有較高遺傳多樣性的同時，也表明AFLP標記技術在油茶遺傳多樣性研究的適用性。馮金玲等［26］探討油茶芽苗砧嫁接體愈合過程中嫁接口和接穗是否發(fā)生基因變化發(fā)現(xiàn)，在接穗母樹、接穗萌發(fā)芽和砧木中有DNA特異條帶的出現(xiàn)。

但是AFLP反應步驟多、過程復雜、影響因素多，很多實驗室因不同的原因難以得到理想的結果，導致該技術在油茶研究中較少見報。近年來，越來越多針對AFLP反應體系構建的研究突破，如：黃永芳等［27］用成熟葉片為材料成功提取了高質量的DNA，打破了對僅能用幼嫩葉片作為提取材料的限制。張婷等［28］，金龍等［25］也分別構建了適于油茶AFLP分析的反應體系。隨著相關技術的進一步成熟，AFLP標記技術在油茶中的應用將會增多。

1.3 油茶SSR標記的應用

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），是于1991年由Moore等創(chuàng)立的分子標記技術之一，該分子標記是共顯性標記，具有單基因座、等位基因變異多、多態(tài)性豐富、信息量大、操作簡單、穩(wěn)定性好、種族特異性強等優(yōu)點，當前在植物育種、指紋數(shù)據(jù)庫構建、品種鑒定等方面得到廣泛應用。

SSR技術在油茶研究中應用暫不多見。彭嬋等［29］利用SSR技術對湖北省油茶種質資源進行分析，結果證明同一地區(qū)的油茶品種相對外地品種具有較近的親緣關系，且各品種間存在一定的差異。黃勇［30］應用SSR標記技術對小果油茶和普通油茶的5個同域分布區(qū)的10個居群復合體進行居群遺傳結構分析，結果顯示小果油茶和普通油茶之間的親緣關系非常接近，存在著因雜交而產(chǎn)生的基因漸滲。

傳統(tǒng)開發(fā)SSR標記方法投入大，工作繁瑣，獲得SSR陽性克隆的機率很低，成功獲得引物的機率則更低［31］。雖然范小寧等和劉冰等［32，33］均對油茶SSR技術的反應體系進行了優(yōu)化，但總的來說，由于SSR標記要預先獲得序列信息，導致該技術的應用受到較大限制。在油茶的研究中，主要還是用SSR技術進行隨機標記，還未發(fā)現(xiàn)有相關研究利用油茶的特異SSR標記進行油茶種質資源的遺傳多樣性分析。

1.4 油茶ISSR標記的應用

簡單重復間序列標記（Inter-simple sequence repeat，ISSR），是由加拿大Zietkiewicz等［34］在1994年提出的一種利用PCR擴增進行檢測的分子標記研究技術。ISSR具有簡便、快捷、結果穩(wěn)定、DNA用量少和DNA多態(tài)性高等優(yōu)點［35］，不需要繁瑣地進行基因文庫構建、雜交和同位素顯示等步驟，重復序列和錨定堿基的選擇是隨機的，無需知道任何靶標序列的SSR背景信息。但ISSR技術呈孟德爾式遺傳，即顯性遺傳標記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

關于油茶ISSR技術還是集中在遺傳多樣性及親緣關系方面。張國武等［36］采用ISSR分子標記，對我國南方10個油茶優(yōu)良無性系進行了遺傳多樣性分析，結果顯示油茶品種間存在較大遺傳差異，并準確地對各無性系進行了分子鑒別。溫強等［37］采用ISSR分子標記方法，對江西25個產(chǎn)量達到750 kg/hm2的油茶無性系進行分子鑒別研究，顯示各無性系遺傳背景復雜。于小玉等［38］利用ISSR技術針對湖北湖南主要油茶品種，代惠萍等［39，40］針對秦巴山區(qū)的油茶品種，王保明等［41］針對湘林系列、岑軟系列等無性系，彭繼慶等［42］針對博白大果油茶（Camellia gigantocarpa）天然種群和人工種群的研究均能鑒定其親緣關系并得到品種、無性系間遺傳多樣性豐富的類似的結果。此外，應用ISSR技術關于油茶分類及鑒定的研究也有見報，劉海龍等［43］對11份山茶屬植物進行測定，成功區(qū)分了5個普通油茶無性系，同時為香花油茶（Camellia osmantha）分類地位的確認提供一定的參考。

關于油茶ISSR分子標記反應體系的篩選及條件優(yōu)化也獲得一定突破［44-46］，相關研究將進一步拓展ISSR技術在油茶中的應用，為油茶的分子輔助育種奠定良好的基礎。

1.5 油茶SRAP標記的應用

相關序列擴增多態(tài)性分子標記（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP），是由Li博士和Quiros博士［47］于2001年創(chuàng)立的一種利用PCR擴增進行檢測的分子標記研究技術。SRAP具有多態(tài)性高、操作簡便、中等產(chǎn)量、高共顯性、低成本、重復性高、易于分離條帶及測序等優(yōu)點［48］，可以同時對外顯子、內(nèi)含子和啟動子區(qū)域進行特異性擴增［49］?；谟筒鑃RAP分子反應體系的研究成果不斷見報［50-54］，為該技術在油茶研究中的進一步推廣奠定了基礎。

王鵬良等［55］利用SRAP技術對岑軟3號油茶組培苗進行分子檢測，表明在以芽繁芽的組織培養(yǎng)體系中具有較好的遺傳穩(wěn)定性。范小寧等［56］對4個控制授粉家系的子代遺傳多樣性進行分析，提出雜交育種培育油茶新品種時應以雜交后代個體選擇為主，優(yōu)良家系選擇對油茶產(chǎn)量提升的潛力較小。黃勇、楊揚等［57，58］利用SRAP技術對全國19個小果油茶居群進行分析，發(fā)現(xiàn)小果油茶的遺傳多樣性在居群和物種2個層次上均較為豐富，不同居群間存在較為頻繁的基因流動，遺傳變異主要來自局群內(nèi)。此外，彭邵鋒等［59］對全國14個油茶高產(chǎn)良種進行遺傳多樣性分析，林萍等［60］對油茶長林系列的研究及韓欣等［61］對贛南油茶良種的研究更進一步地建立了該類油茶良種的分子鑒別體系。

近年來，SRAP分子標記雖在油茶研究中廣泛應用，為油茶遺傳多樣性及遺傳穩(wěn)定性的鑒定提供了良好的分析手段，但可應用于油茶優(yōu)良種質分子鑒別研究的SRAP引物較少，且該技術的穩(wěn)定性仍需進一步提高［61］。

2 存在的問題

油茶屬異花授粉植物，在我國分布范圍較廣泛，在長期的自然生長和人工選擇下，不同區(qū)域、不同品種、甚至不同近緣種之間不斷雜交，導致種內(nèi)變異極其豐富，遺傳背景非常復雜，多種分子標記均驗證了這種現(xiàn)象。雖然DNA分子標記技術在油茶品種及近緣種鑒定、遺傳多樣性、親緣關系等研究中取得了不少成果，展現(xiàn)了廣闊的應用前景，但是仍然存在一些不足：（1）當前分子標記主要開展針對油茶遺傳多樣性和遺傳距離的研究，與性狀連鎖開展的研究較少見報。（2）在已廣泛應用的RAPD、ISSR等分子標記技術只能作為診斷性的分子標記初步定位出與部分性狀相關的譜帶，雖然越來越多的特異性譜片段被標記出來，但幾種分子標記技術均未能對目的基因精確定位和有效分離，難以直接應用在實際生產(chǎn)中。（3）當前分子標記的研究并未能較好地參與到油茶遺傳圖譜的構建，遺傳圖譜的不完善延緩了相關功能基因的發(fā)現(xiàn)。（4）現(xiàn)有的研究較少采取多種分子標記綜合應用，與形態(tài)學、細胞學以及其他的一些生物技術手段綜合評價較少開展。（5）在油茶的遺傳育種中，分子標記育種與常規(guī)育種還未能很好結合，大多數(shù)分子標記仍停留在實驗室階段，在實際育種過程中僅僅作為一種輔助育種的工具。

3 展望

未來的研究，應進一步加大對油茶豐產(chǎn)、高油、抗病蟲害、抗逆境脅迫等方面相關的功能基因挖掘和利用的力度。充分應用分子標記技術鑒別并分離與重要農(nóng)藝性狀相關的特殊基因，獲得與其緊密連鎖的分子標記，加快在分子輔助育種上的應用進程［62］；同時，應進一步開發(fā)和利用永久性群體所構建高密度遺傳圖譜，對其重要性狀進行準確QTL定位［63］，加強與實際生產(chǎn)的聯(lián)系。近年來，油茶cDNA文庫［64］、EST文庫［65，66］，轉錄組［67，68］，葉綠體基因組［69］等逐步構建，這些標志性成果將油茶分子生物學的研究推向新的高度。可以預見在不久的將來，針對油茶基因組學、轉錄組學及蛋白組學的研究將是油茶分子生物學新的熱點。此外，油茶全基因組測序也必將被公布，隨著核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的公共化和各組學的深入研究，利用相關資源開發(fā)出更為直接有效的分子標記技術，諸如已在相應植物研究中陸續(xù)取得成功的cDNA-AFLP［70，71］、cDNA-SRAP［72］和EST-SSR［73］等，這類新型分子標記技術的應用必將極大推動油茶各方面的研究。同時，還應借助生物信息學等手段開展與茶（Camellia sinensis）、山茶（Camellia japonica）等近緣種核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的比對，此舉必將獲得大量與重要農(nóng)藝性狀相關的功能基因，定位也將越來越精確。屆時，油茶分子標記輔助育種將會得到更快速發(fā)展，從而為選育綜合性狀優(yōu)良的油茶新品種提供更加有力的支持。

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（責任編輯 狄艷紅）

Application of Molecular Markers in Studies of Camellia oleifera

Dong Bin1，2Li Rongxi1Huang Yongfang2Hong Wenhong2Tan Sha2
（1. Guangdong Agriculture Industry Business Polytechnic College，Guangzhou 510507；2. South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

Recently the molecular marker techniques develop rapidly and are widely used in studies of Camellia oleifera. Owing to advantages of high-efficiency and reliability with molecular marker technique， its rapid development offers fast and efficient measure in genetic diversity analysis， cultivar identification， valuable gene mapping， molecular marker-assisted selection and the construction of molecular gen etic maps. The applications of several molecular marker techniques， i.e.， RAPD， AFLP， SSR， ISSR and SRAP etc. in studying C. oleifera are reviewed. The current problems and the focuses in the future researches are also discussed while utilizing the molecular marker in studying C. oleifera.

molecular marker；Camellia oleifera；genetic diversity；gene mapping；molecular marker-assisted selection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.011

2014-09-29

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項資金項目（2011KJCX014-01），廣東省科技計劃項目（2011B0203003）

董斌，男，碩士，講師，研究方向：園林植物及經(jīng)濟林的科研與教學；E-mail：bbeenn@163.com

黃永芳，女，教授，碩士生導師，研究方向：經(jīng)濟林及森林培育的科研和教學；E-mail：hyfang@scau.edu.cn