肖海峻，孟利前，施鵬飛

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京102442）

響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯花青素的超聲波提取工藝

肖海峻，孟利前，施鵬飛

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京102442）

超聲波技術(shù)是用于天然產(chǎn)物有效成分提取的一種非常有效的方法。本試驗(yàn)中以紫甘薯為研究對(duì)象，利用該技術(shù)對(duì)影響花青素提取的影響因素提取劑比例、提取溫度、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以吸光度為響應(yīng)值，研究上述幾個(gè)因素對(duì)花青素的影響并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)是：提取溫度49℃，提取時(shí)間15min，料液比1∶41（g/mL），在此條件下紫甘薯花色苷吸光度達(dá)到1.45。

響應(yīng)面分析法（RSM）；紫甘薯；花青素；超聲波提取技術(shù)

植物色素在植物中分布廣泛，種類繁多，花青素是一類花色素糖苷類化合物的水溶性色素，在自然狀態(tài)下，與植物體內(nèi)的各種單糖結(jié)合形成糖苷，又稱花色苷（Anthocyanins）[1]，花青素在酸性條件下呈紅色或紫色，熱、光、氧穩(wěn)定性較好，其顏色的深淺與花青素的含量呈正相關(guān)。具有優(yōu)越的著色性能，已作為食品添加劑應(yīng)用于配料酒、飲料、冰激凌、果醬、糕點(diǎn)等產(chǎn)品[2-3]。此外，花青素還具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎、抗癌以及預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病等多種生理功效[4-7]，被廣泛應(yīng)用在藥品、食品、化妝品等方面。

花青素提取過程中常用到的提取劑主要有甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但這些提取劑的殘留會(huì)對(duì)花青素的應(yīng)用造成負(fù)面影響，為解決上述問題，有學(xué)者采用酸化乙醇替代有機(jī)溶劑提取紫薯花青素[8-9]。本試驗(yàn)是在前人研究的基礎(chǔ)上，以乙醇鹽酸為提取劑，利用超聲波提取技術(shù)對(duì)紫甘薯花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索紫甘薯花色苷提取的最佳工藝參數(shù)，為花青素的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紫羅蘭，由大興區(qū)龐各莊鎮(zhèn)甘薯基地提供。

1.2 所用儀器型號(hào)及生產(chǎn)商

FW80高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；GL-88B旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-300型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Eppendorf離心機(jī)5804R：北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司；SHB-Ⅲ真空循環(huán)水勢(shì)多用泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯粉的制備

將紫色甘薯洗凈、切成3 mm薄片，然后在烘箱45℃條件下烘干至恒重，粉碎后過60目篩，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 方法

精確稱取紫薯粉1.0 g，加入適量的提取劑（由95%乙醇和0.1%HCl按比例混合而成），按設(shè)定的提取溫度、提取時(shí)間及料液比在超聲波下提取，樣品在離心機(jī)中以3 500 r/min離心5min，得到澄清的花青素上清液，將上清液取出并定容到100mL，放入紫外分光光度計(jì)中在波長(zhǎng)為520 nm下測(cè)其吸光度，記錄結(jié)果，每組試驗(yàn)3次重復(fù)取平均值[10-12]。

1.4 設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

1.4.1.1 最佳提取劑比例的篩選

將95%乙醇和0.1%HCl分別按比例為50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70和25∶75的比例配制，然后按料液比為1∶10加入提取劑進(jìn)行超聲波輔助萃取，超聲浸提的溫度為40℃，超聲波震蕩時(shí)間為15min，然后離心5min，將上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.4.1.2 最佳提取溫度的篩選

超聲波浸提溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70℃，按照料液比為1∶10加入提取劑（95%乙醇和0.1% HCl的比例為40∶60）進(jìn)行超聲輔助萃取，超聲波震蕩時(shí)間為15min，然后離心5min，將上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.4.1.3 最佳提取時(shí)間的篩選

超聲波震蕩時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min，按照料液比為1∶10加入提取劑（95%乙醇和0.1%HCl的比例為40∶60）進(jìn)行超聲輔助萃取，超聲波浸提溫度為40℃，然后離心5min，將上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.4.1.4 最佳料液比的篩選

料液比分別設(shè)置為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，加入提取劑（95%乙醇和0.1%HCl的比例為40∶60）進(jìn)行超聲輔助萃取，超聲波浸提溫度為40℃，超聲波浸提時(shí)間為15min，然后離心5min，將上清液吸出并定容至100mL，在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，將自變量的實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼（因素水平設(shè)計(jì)見表1），以吸光度為響應(yīng)值進(jìn)行分析，共設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 提取劑比例對(duì)吸光度的影響

從圖1可以看出，在其他條件不變的情況下，提取劑（95%乙醇∶0.1%HCl）按照不同的體積比例配制時(shí)，對(duì)吸光度的影響比較大。隨酸的含量增加時(shí)，吸光度的值也增加，當(dāng)95%乙醇和0.1%HCl比例達(dá)到35∶65時(shí)，吸光度的值達(dá)到最大，表明此時(shí)花青素的含量達(dá)到最高，提取效果最好。超過該值時(shí)，當(dāng)酸的含量再繼續(xù)增加時(shí)，吸光度的值反而減小了，表明花青素的提取率下降了。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與花青素結(jié)構(gòu)有關(guān)，花青素結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，有酸性，此外其結(jié)構(gòu)中的吡喃雜環(huán)上的氧原子為四價(jià)，使其具有堿性，其兩性特征使花青素的色調(diào)以及穩(wěn)定性受pH變化的影響較大。提取劑的pH過高或者過低都會(huì)直接影響到色素的提取效果和色素的色調(diào)。

2.1.2 提取溫度對(duì)吸光度的影響

當(dāng)提取劑比（95%乙醇∶0.1%HCl）為40∶60，料液比為1∶10，超聲波震蕩時(shí)間為15min時(shí)觀察不同浸提溫度對(duì)吸光度的影響。

由圖2可以看出，在30℃到50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，吸光值呈增加趨勢(shì)，表明提取液花色苷含量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí)花色苷含量最高，表明此時(shí)花青素含量達(dá)到最大；50℃之后，花色苷含量隨溫度的升高而降低，這可能是由于過高的溫度會(huì)對(duì)花青素具有破壞作用從而降低其含量。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響

當(dāng)提取劑比（95%乙醇∶0.1%HCl）為40∶60，料液比為1∶10，超聲波清洗器的溫度為40℃時(shí)觀察不同浸提時(shí)間對(duì)吸光度的影響。

由圖3可知，吸光度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為15min時(shí)達(dá)到最大值，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是：由于開始時(shí)花青素隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷被溶解出，在不太長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)即可提取得較為完全；色素在加溫溶液中穩(wěn)定性可能隨時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生變化，因此當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，花青素因氧化分解反而致使含量降低。

2.1.4 料液比對(duì)吸光度的影響

當(dāng)提取劑比（95%乙醇∶0.1%HCl）為40∶60，超聲波清洗器的溫度為40℃，超聲波震蕩時(shí)間為15min時(shí)觀察不同料液比對(duì)吸光度的影響。

由圖4可知，吸光度隨提料液比的增加而增加，在料液比為1∶40時(shí)達(dá)到高峰，之后隨料液比的增加有增大的趨勢(shì)，但趨于平緩。這可能是隨著提取劑加入量的增加，色素逐漸溶解到溶液中，當(dāng)提取劑達(dá)到一定量時(shí)，色素溶解趨于飽和，即料液比在1∶40時(shí)花青素含量趨于飽和，達(dá)到比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取紫薯花青素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

應(yīng)用響應(yīng)面法，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，通過對(duì)表2中吸光度試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和回歸模型方差分析（表3），獲得紫甘薯花青素吸光度對(duì)編碼自變量提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

吸光度=1.44623-0.032 55A＋0.021 89B＋0.029 91C＋0.041 69AB-0.059 66AC-0.007 78BC＋0.002 69BC-0.174 21A2-0.115 52B2-0.095 36C2

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)于超聲波提取對(duì)紫薯花青素吸光度的影響，一次項(xiàng)的偏回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值A(chǔ)> C>B，說明提取溫度對(duì)紫甘薯花青素吸光度影響最大，其次是料液比，影響最小是提取時(shí)間。

從表3可以看出，本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著性（PModel＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P= 0.463 4＞0.05），回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.993 56，說明該模型能夠解釋99.356%的響應(yīng)值變化，模型擬合程度較好，對(duì)實(shí)踐具有指導(dǎo)意義，可以用此模型對(duì)紫甘薯花青素的吸光度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

為了觀察某個(gè)因素及其交互作用同時(shí)對(duì)吸光度的影響，將其他因素條件保持不變，獲得每個(gè)因素及其交互作用對(duì)吸光度影響的一組動(dòng)態(tài)等高線圖及其響應(yīng)曲面圖（圖5～圖7），從而確定因素的最佳水平范圍。

從提取溫度和提取時(shí)間對(duì)吸光度的等高線和響應(yīng)曲面（圖5）可以看出，當(dāng)料液比達(dá)到最佳值時(shí)，隨著提取溫度的增加，吸光度先增大后減小；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度先增大后減小。由圖5可以確定最佳水平范圍即提取溫度為48℃～50℃，提取時(shí)間為14min～16min。

從提取溫度和料液比對(duì)吸光度的等高線和響應(yīng)曲面（圖6）可以看出，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到最佳值時(shí)，隨著提取溫度的增加，吸光度先增大后減小；隨著料液比的增加，吸光度先增大后減小。由圖6可以確定最佳水平范圍即提取溫度為49℃～51℃，料液比為1∶38 g/m L～1∶42 g/m L。

從提取時(shí)間和料液比對(duì)吸光度的等高線和響應(yīng)曲面（圖7）可以看出，當(dāng)提取溫度達(dá)到最佳值時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度先增大后減?。浑S著料液比的增加，比吸光度先增大后減小。由圖7可以確定最佳水平范圍即提取時(shí)間為14min～16min，料液比為1∶39 g/mL～1∶41 g/mL。

等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反；同時(shí)響應(yīng)面圖三維圖的形狀也反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，陡為兩因素交互作用顯著，而不陡則與之相反；由圖5至圖7可知，提取溫度和料液比交互作用及其顯著，提取溫度和時(shí)間交互作用顯著，但提取時(shí)間和料液比交互作用不顯著。

2.3 最優(yōu)提取工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

通過Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得到回歸方程的最大值點(diǎn)為提取溫度49.41℃，提取時(shí)間15.34min，料液比1∶40.96，預(yù)期的吸光度為1.451 74?？紤]到實(shí)際操作中遇到問題，將提取工藝條件修正為：提取溫度49℃，提取時(shí)間15min，料液比1∶41 g/mL，按此工藝參數(shù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，吸光度為1.445 73，與理論預(yù)測(cè)值1.451 74相比，相對(duì)誤差為0.601%，證明了方程的可靠性與響應(yīng)面分析法的有效性。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法建立了超聲波提取紫薯花青素的數(shù)學(xué)模型，以吸光度為響應(yīng)值，各因素影響的主次順序?yàn)椋航釡囟?料液比>提取時(shí)間。通過提取工藝響應(yīng)面研究，確定了超聲波提取紫薯花青素的最佳工藝參數(shù)為：提取溫度49℃，提取時(shí)間15min，料液比1∶41 g/mL，在此條件下紫甘薯花色苷吸光度達(dá)到1.45。綜上所述，利用響應(yīng)曲面法對(duì)紫甘薯花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，可以減少工藝操作的盲目性，為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定一定基礎(chǔ)。

[1]趙宇瑛,張漢鋒.花青素的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].安徽農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,33(5):904-905,907

[2] 凌關(guān)庭．食品添加劑手冊(cè)[M]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1997:543－545

[3] Kongjm, Chials, Gohnk, et al． Analysisandbio -Logicalactivities ofanthocyanins[J]．Phytochemistry,2003,64(5):923－933

[4] Yasuko Nods,Takao Kneyuki,Kiharu Igarashi,et al.Antioxidant activity of nasunin ananthocyanin in eggplant peels[J].Toxicology, 2000,148(2/3):119-23

[5] Tosawa.Protectiveeffectsofdietarycyanidin-3-O-β-D-gLucosideonLiverischemia-reper fusionin juryinrats [J]. ArchBiochem Biophys,1999,368(3):361-366

[6] Zhuhm Zhaom.StudyonchemicaLconstituentsandan-tioxidantactivityofanthocyaninsfromIpomoeabatatasl． (purples weet potato) [J]．Chemistryand Industry of Forest Products,2009,29(1):39－45

[7]孫建霞,張燕,胡小松,等．花青素的提取、分離以及純化方法研究進(jìn)展[J]．食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(8):111－117

[8] Escribano－Bail nmt,Santos－Buelgac,Rivas－Gonzalojc．Anthocy aninsincereals[J]．Journal ofChro-matography A,2004,1054(1/2): 129－141

[9] Markakisp．Anthocyaninsas Food Colors[M]．New York:Academic Press,1982:163－207

[10]楊朝霞.紫甘薯花色苷色素提取純化工藝研究及組分分析[D].青島大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004(5):34-36

[11]Goda Y,shimizut,Kato Y.Two acylaled anthocyanins of purple sweetpotato phytochemistry[J].1997,44(5):183-186

[12]顧紅梅,張新申,蔣小萍.紫薯中花青素的超聲波提取工藝[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2004,16(3):404-408

[13]Corrales M,Toepfl S,Butz Petal.Extraction of athocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics high hydrostatic pressure or pulsed Lectric fields:A Comparison[J].Innov Food Sci Emerg Technol,2008,9(1):85-91

[14]洪楠,侯軍,李志輝.MINITAB統(tǒng)計(jì)分析教程[M].北京:電子工業(yè)出版社,2007

[15]唐軍虎,康瑋麗,任志艷,等.響應(yīng)面法玉米蛋白肽鋅制備條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011(3):294-300

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction for Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Method

XIAO Hai-jun，MENG Li-qian，SHI Peng-fei
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing102442，China）

Ultrasound technology is a very useful way which is used to extract active ingredients from natural product.In this experiment，some factors affecting the ratio of extraction of proanthocyanidins such as extraction solvent ratio，extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquid are studied respectively by ultrasound technology based on purple sweet potatos.The preparation process of anthocyanins from purple sweet potato was optimized according to Box-Behnken central composition design principle on foundation of single factor experiment，the method of response surface methodology（RSM）with 3 factors and 3 levels combined with Design-Expert data analysis software was adopted with the extraction yield of anthocyanins from purple sweet potato as the absorbance.The effect of several factors above on the efficiency of extraction of anthocy anins from purple sweet potato were studied in this paper.According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows：extraction temperature 49℃，extraction time 15min，ratio of material to liquid 1∶41（g/mL）.Under these conditions，the absorbance of anthocyanins from purple sweet potato reached 1.45.

response surface methodology （RSM）；purple sweet potato；anthocyanins；ultrasonic-assisted extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.009

2013-12-18

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院博士基金項(xiàng)目—紫甘薯花青素提取工藝研究

肖海峻（1966—），女（漢），教授，博士，研究方向：植物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用。