丁文珺, 王珊珊*, 任婧祺, 李 歌, 詹佳鵬

1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院, 遼寧 撫順 113122;2.遼寧省撫順市獸藥飼料監(jiān)察所, 遼寧 撫順 113006

植物內(nèi)生菌研究進展

丁文珺1, 王珊珊1*, 任婧祺2, 李 歌1, 詹佳鵬1

1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院, 遼寧 撫順 113122;2.遼寧省撫順市獸藥飼料監(jiān)察所, 遼寧 撫順 113006

內(nèi)生菌由于生長于植物體內(nèi)且不引起植物病害所以不易被發(fā)現(xiàn)，它是一類具有高實用價值的植物內(nèi)生微生物。經(jīng)過人們的不斷研究，越來越多的植物內(nèi)生菌被發(fā)現(xiàn)，其活性代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢也得到了更多研究者的認可。綜述了國內(nèi)外有關(guān)植物內(nèi)生菌研究的主要成果和進展，并從植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)、研究歷史、多樣性、生理生化特性以及植物內(nèi)生菌與宿主植物間的作用關(guān)系等多個層次進行了概述，以期為植物內(nèi)生菌相關(guān)研究提供參考。

植物；內(nèi)生菌；抑菌研究

內(nèi)生菌是指在植物生長生存的過程中，能與植物達到共生、寄生、腐生等關(guān)系且在植物的整個生命過程中無明顯負面影響的一類微生物。內(nèi)生菌普遍存在，且數(shù)量龐大、種類眾多。其在植物生長的至少一個階段里，會與植物產(chǎn)生極微妙的關(guān)系，它們大部分會長時間、非干擾性地、無癥狀地生活在活體植株的組織中[1]。對內(nèi)生菌的研究開始于19世紀(jì)中期，至今已有一百多年的歷史，研究者從高等植物的莖葉化石中發(fā)現(xiàn)了與植物相關(guān)的微生物，這一研究證明早在地球出現(xiàn)高等植物時，微生物與植物的相互作用就開始演變[2]。在19世紀(jì)中期，研究者們從30多種高等植物中均發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌的存在，其中最引人矚目的是產(chǎn)羊茅草毒的致病微生物Neotyphodiumcoenophialum的分離及其致病機理的研究[3]。到20 世紀(jì) 90 年代，Stierle等[4]從短葉紅豆杉韌皮部分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，植物內(nèi)生菌的研究開始廣泛開展。常見的內(nèi)生菌類型包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌，其中，內(nèi)生真菌是最常被分離出來的一類內(nèi)生菌。

植物內(nèi)生菌是一類純天然活性物質(zhì)，有著獨特且重要的應(yīng)用價值，因此在醫(yī)藥、食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)等方面都有較好的可利用空間。以銀杏為例，銀杏作為一種古老的植物，以其獨特的生理活性而備受關(guān)注，目前已知銀杏的藥用成分有170余種，包括：黃酮類、內(nèi)酯類、有機酸類、氨基酸、糖類和醇類等，研究顯示銀杏中分離出的銀杏內(nèi)生菌不僅多樣性水平較高，而且較為穩(wěn)定，具有較高的生物活性。現(xiàn)已從內(nèi)生菌中分離純化得到許多抗微生物活性、抗細胞毒性活性、清除自由基活性和抗癌活性等高活性物質(zhì)。近20年來人們對植物內(nèi)生菌展開了更為深入的研究，得到了很多有價值的研究成果，但相對于其他微生物的研究，植物內(nèi)生菌的研究還存在很多不清楚的地方。目前預(yù)計自然界中存在有100萬種植物內(nèi)生菌[5]。但如此龐大的內(nèi)生菌群至今被發(fā)現(xiàn)的還不到15%[6]。本文介紹了植物內(nèi)生菌的研究進展與發(fā)展概況，以期為植物內(nèi)生菌的研究及天然產(chǎn)物的挖掘提供參考。

1 內(nèi)生菌的多樣性

自1898年Vogl從黑麥草(LoliumtemulentumL.)種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生菌，越來越多的內(nèi)生菌被分離出來。內(nèi)生菌的分布極廣，普遍存在于各種陸生和水生植物當(dāng)中，現(xiàn)已從苔蘚類、蕨類、擬蕨類、角苔類、草本植物和各類木本植物中分離出內(nèi)生菌，地域也從熱帶到北極，從自然野生到農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)[7]。從同種植物當(dāng)中分離出的內(nèi)生菌種類和數(shù)量也千差萬別，目前研究的內(nèi)生菌主要集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)，常見植物有紅豆杉、蘆薈、桃兒七、杜仲、喜樹和銀杏等，這些植物中都含有不止一種內(nèi)生菌，在每種植物的根、莖、葉、果實等器官、組織細胞和組織間隙當(dāng)中也都存在著不同數(shù)目和種類的內(nèi)生菌[8]。

2 內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的活性

由于長期的共同進化，植物內(nèi)生菌與寄主建立了良好的互利共生關(guān)系，使得原本僅植物才能產(chǎn)生的活性物質(zhì)也可以由內(nèi)生菌代謝產(chǎn)出相同或相似的物質(zhì)[9],而此類天然產(chǎn)物因結(jié)構(gòu)復(fù)雜和內(nèi)在的生物學(xué)潛力具備了完美的化學(xué)活性[10]，使植物內(nèi)生菌研究具有良好的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

2.1 產(chǎn)生重要的藥理活性

內(nèi)生菌可以利用自身代謝產(chǎn)物與植物中的某些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生新的化合物或利用植物體內(nèi)的活性物質(zhì)做為前體物質(zhì)，經(jīng)內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化體系產(chǎn)生新的活性成分[11]。對生物活性和群落生境相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，相對于從土壤中分離到的菌種，內(nèi)生真菌有更好的除草和抑制藻類生長的能力[12]。楊清香等[13]利用平板分離法從懷地黃中分離出對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉等均具有較強拮抗作用的8株內(nèi)生菌，研究發(fā)現(xiàn)8種內(nèi)生菌對食管癌細胞系具有抑制作用, 因此具有重要的開發(fā)價值。 任娜[14]采用超高效液相色譜與GC-MS 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌能對艾葉油進行生物轉(zhuǎn)化，并得到了新的萜類物質(zhì)。彭清忠等[15]從姜黃根莖中篩選到一株能產(chǎn)甲基姜黃素和二去甲基姜黃素的內(nèi)生菌，研究同時表明：內(nèi)生菌產(chǎn)生的去甲基姜黃素的抗氧化、抗炎癥活性比姜黃素高。由此看來，植物內(nèi)生菌給研究人員帶來了新的思路：植物內(nèi)生菌具有良好的藥理活性，且研究成本較低、對環(huán)境空間要求低、生長速度快、易控制，在新藥特藥的研發(fā)和應(yīng)用方面具有不可估量的潛在價值。

2.2 增強植物對外界環(huán)境的抵抗能力

內(nèi)生菌與宿主植物長期協(xié)同進化的過程中，二者形成了互利共生的關(guān)系。一方面，宿主植物利用光合作用為內(nèi)生菌提供營養(yǎng)；另一方面，內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝物如一些促生、抗菌的物質(zhì)，能夠促進植物生長發(fā)育，提高植物抗蟲、抗逆能力，從而增強植物對外界環(huán)境的抵抗能力。最初報道內(nèi)生菌能協(xié)助植物抵抗外界干擾的例子是榆樹內(nèi)生菌P.oblonga能產(chǎn)生拒食性毒素抑制甲蟲對榆樹的危害，從而減少了荷蘭榆樹病致病因子的傳播[16]。隨著研究的不斷深入，研究人員提出了防御互利共生假說，植物的不同部位對植食性動物或植物病原菌的攻擊所產(chǎn)生的壓力不同，以至在不同植物內(nèi)部的內(nèi)生菌也并非全部產(chǎn)生防御物質(zhì)，而是可能產(chǎn)生馬賽克效應(yīng)來保護宿主植物，形成各自的后天免疫系統(tǒng)[17,18]。目前對內(nèi)生菌產(chǎn)生的用于防御的物質(zhì)研究最多的是毒性生物堿，如麥角生物堿等。內(nèi)生菌在宿主和純培養(yǎng)時會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，這些物質(zhì)對植食性動物、植物病原菌、線蟲、昆蟲等都有毒害作用。另外內(nèi)生菌還可以提高植物的抗旱[19]、抗鹽堿[20]等能力。

2.3 促進植物氮吸收能力

隨著人們對農(nóng)產(chǎn)品的需求量日益增長，氮的有效供給成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基本保證，為提高農(nóng)產(chǎn)品在單位面積上的產(chǎn)量，氮肥的使用量也逐年增加。但是，氮肥的大量使用，會造成土壤的理化性狀惡化、氮肥的利用率下降、水體富營養(yǎng)化、資源浪費和環(huán)境污染等一系列問題[21]。而偏施氮肥也不利于農(nóng)作物產(chǎn)量的提高和優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)[22]。

植物通過根系吸取土壤中的氮素，根系的形態(tài)特征(根系總長、根系半徑、根體積、有效吸收面積)、分布和根系活力直接影響到植物吸收氮素能力的強弱[23]。而內(nèi)生菌的存在能夠促進根的生長和根系活力[24]，達到促進植物對氮素吸收的效果。目前認為內(nèi)生固氮菌的存在能夠為宿主植物提供無機氮源以提高植物的固氮能力: 內(nèi)生固氮菌都含有固氮酶，它們可以在宿主植物的各種營養(yǎng)器官中以相當(dāng)高的數(shù)量存在并發(fā)揮固氮作用，直接為植物提供無機氮源，且不會引起宿主任何不良反應(yīng)[25，26]；有些固氮菌將固定的氮素直接供給植物吸收同化，有些則固定大氣中的氮氣將部分氮氣供給宿主吸收利用[27]，其余部分則被內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化為細胞氮供自身利用，由于內(nèi)生菌的生命周期比植物短，內(nèi)生菌死亡崩解后釋放的氮素也能被植物根系吸收。

3 展望

我國國土資源遼闊，得天獨厚的地域孕育了十分豐富的動植物和微生物資源。目前我國藥物成分來源主要為天然藥物產(chǎn)物和人工合成產(chǎn)物。

天然產(chǎn)物與合成化合物相比具有更為廣大和復(fù)雜的空間，不僅如此，天然產(chǎn)物還包含多環(huán)的立體異構(gòu)體，這種立體異構(gòu)體由于太過復(fù)雜，即使投入大量人力和財力進行研究，也未必能在短時間內(nèi)獲得產(chǎn)品。另外植物在合成某種天然產(chǎn)物的同時也會賦予產(chǎn)物大量的功能基團，并伴隨出現(xiàn)加大人工合成難度等問題。內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物同時具有天然活性產(chǎn)物所有的優(yōu)越性以及菌體本身繁殖速度快的優(yōu)點，可以使天然產(chǎn)物在短時間內(nèi)被大量制造。

內(nèi)生菌與宿主植物協(xié)同進化的過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有高度協(xié)同性和相似性，這種特性使內(nèi)生菌迅速成為研究熱點。但事實卻是：我們對內(nèi)生菌的研究還處于初級階段。除現(xiàn)有理論體系和科研技術(shù)的不完善外，人們對內(nèi)生真菌認識的匱乏和內(nèi)生菌菌體本身對外界環(huán)境適應(yīng)能力太強，產(chǎn)物不穩(wěn)定，離體培養(yǎng)后會出現(xiàn)特性退化和消失等都阻礙了人們對內(nèi)生菌的研究。

目前，對于內(nèi)生菌理論體系研究仍然不是很明確，具體表現(xiàn)為以下三個方面：①基礎(chǔ)理論方面的研究:內(nèi)生真菌入侵宿主的分子機理、內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)生命活動的分子調(diào)控、在廣泛的地理范圍內(nèi)對更多的植物進行內(nèi)生真菌多樣性的研究、內(nèi)生真菌對宿主和組織專一性機理、分布等生態(tài)學(xué)問題仍有待進一步研究。②次級代謝理論基礎(chǔ)：內(nèi)生菌的次級代謝產(chǎn)物理論、水平基因轉(zhuǎn)移、防御共生假說、Xenohormesis假說、內(nèi)生菌專一固有特質(zhì)假說、內(nèi)生菌與植物之間的信號交流、內(nèi)生菌與內(nèi)生菌之間的信號交流等機制尙不明確。③實際應(yīng)用方面的研究:內(nèi)生真菌在植物活力和環(huán)境污染檢測方面的應(yīng)用、內(nèi)生真菌作為植物病害的生物防治、內(nèi)生真菌產(chǎn)生的重要生物活性物質(zhì)和酶的篩選等仍需深入研究和挖掘。

現(xiàn)代內(nèi)生菌次級代謝假說的層出不窮，說明我們對內(nèi)生菌研究仍處于初級階段，但同時也說明內(nèi)生菌研究存在巨大的潛力。目前研究人員對借助宏基因組技術(shù)以突破內(nèi)生菌鑒定、分離、培養(yǎng)的“瓶頸”寄予厚望。筆者認為利用生物技術(shù)創(chuàng)建內(nèi)生菌宏基因組計劃是研究內(nèi)生菌的重要方向之一，研究人員計劃將宏基因組克隆技術(shù)應(yīng)用于植物內(nèi)生菌多樣性分析及功能篩選中，同時減少分離培養(yǎng)過程中內(nèi)生菌多樣性丟失，避免內(nèi)生菌離體培養(yǎng)后自身特性的消失和退化，并增加了獲得特殊活性物質(zhì)的機會，但內(nèi)生菌宏基因組的建立需要耗費大量的時間、人力與物力，因此現(xiàn)階段內(nèi)生菌相關(guān)知識的完善與推廣變得格外重要。內(nèi)生菌具有很好的應(yīng)用模式以及潛在的商業(yè)價值，但想要服務(wù)于生產(chǎn)實踐，仍需要大量的實驗支撐。隨著醫(yī)藥和農(nóng)藥行業(yè)的飛速發(fā)展，人類病原菌的多重抗性持續(xù)增加以及超級細菌的出現(xiàn)，這些都提醒著我們需要研發(fā)新藥代替經(jīng)典藥品。歐洲聯(lián)邦制藥行業(yè)和協(xié)會啟動了藥物創(chuàng)新計劃(IMI)解決耐藥性問題，以加速新抗生素的研發(fā)。Barbara等比較了135個已鑒定結(jié)構(gòu)的代謝物表明，內(nèi)生菌產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)的比例是51%。這就意味著內(nèi)生菌這類微生物能產(chǎn)生高比例的新穎化合物，在尋找新型且療效顯著的藥品替代品方面，內(nèi)生菌是未來重要的發(fā)展方向。

[1] Bacon C W, White J. Microbial Endophytes [M]. New York: Marcel Deker Inc.,2000.

[2] Redecker D,Kodner R,Graham L E. Glomalean fungi the Ordovician [J].Science,2000,289(5486):1920-1921.

[3] Bacon C,Porter J,Robbins J,etal..Epichloёtyphinafrom toxic tall fescue grasses[J].Appl. Environ. Microbiol.,1977,34(5):576-581.

[4] Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production byTaxomycesandreanae, an endophytic fungus ofPacificyew[J]. Science, 1993, 260(5105)：214-216.

[5] Guo B, Wang Y, Sun X,etal.. Bioactive natural products from endophytes:a review[J]. Biochem. Microbiol., 2008, 44(2)：136-142.

[6] 江軍山, 張 鑫. 產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)植物內(nèi)生菌的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(22)：11704-11705.

[7] Arnold A E. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress, challenges, and frontiers [J].Fungal Biol. Rev.,2007,21(2-3):51-66.

[8] 郝曉娟, 植物內(nèi)生菌[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2010，1-40.

[9] Zhao J,Shan T,Mou Y,etal.. Plant-derived bioactive compounds produced by endophytic fungi [J].Mini Rev. Med. Chem.,2011,11(2):159.

[10] Clardy J,Walsh C. Lessons from natural molecules[J].Nature,2004,432(7019):829-837.

[11] 彭清忠，陳 玲，易浪波，等.內(nèi)生真菌對姜黃素的微生物轉(zhuǎn)化[J] 生物技術(shù)通訊 ，2010，21: 196-199.

[12] Schulz B,Boyle C,Dreger S,etal.. Endophytic fungi:a source of novel biologically active secondary metabolites[J].Mycol. Res.,2002,106(9):996-1004.

[13] 楊清香，謝永生，張 昊，等.懷地黃活性內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌抗腫瘤活性[J].微生物學(xué)通報，2010,37(10):1467-1474.

[14] 任 娜. 紅豆杉內(nèi)生真菌遺傳多樣性分析和生物轉(zhuǎn)化的研究[D]. 長沙:中南大學(xué),碩士學(xué)位論文，2011.

[15] Denise Z L B, Ida C P, Daniel A J,etal.. Biotransformation of betulinic andbetulonic acids by fungi[J]. Phytochemistry，2007,6: 834-839.

[16] Webber J,Gibbs J. Colonization of elm bark by phomopsis oblonga[J].Transac. British Mycol. Soc.,1984,82(2):348-352.

[17] 王瑞珍.2株銀杏內(nèi)生真菌的抑菌活性研究[D].福建:福建農(nóng)業(yè)大學(xué),碩士學(xué)位論文，2013，1-64.

[18] Arnold A E,Mej A L C,Kyllo D,etal.. Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2003,100(26):15649-15654.

[19] Petrini O. Fungal endophytes of tree leaves[A].In:Andrews J H,Hirano S S. Microbial Ecology of Leaves[M]. New York:Springer-Verlag,1991,179-197.

[20] 李 嬌，張寶龍,趙 穎,等.內(nèi)生菌對提高植物抗鹽堿性的研究進展[J].生物技術(shù)通報，2014,4:14-18.

[21] 楊 波，陳 晏，李 霞,等. 植物內(nèi)生菌促進宿主氮吸收與代謝研究進展[J]. 生態(tài)學(xué)報，2013，33(9):2656-2664.

[22] Graham P. Vance C. Nitrogen fixation in perspective: an over view of research and extension needs[J]. Field Crops Res.，2000，65:93-106.

[23] Fan J B，Zhang Y L，Wang D S，etal.. Research progress on high nitrogen uptake and utilization by rice plants[J]. J. Nanjing Agric. Univ.，2008，31(2): 129-134.

[24] Wang K，Yang Y A，Yuan K N. Effects of three vitamins on the growth and physiological properties in wheat[J]. Bull. Sci. Technol.，1995，5: 301-305.

[25] D bereiner J，Pimentel J P，Olivares F L，etal.. Bacteria diazotróficaspodem ser endófitas e/ou fitopathogěnicas[J]. Anais Acad. Brasil. Ciências，1990，6(2): 319-324.

[26] Zhang L M，F(xiàn)ang P，Zhu R Q. Recent advances in research and application of associated nitrogen-fixation with graminaceous plants[J]. Chin. J. Appl. Ecol., 2004，9:1650-1654.

[27] Sun L，Song W. Applications of culture-independent method in the researching of endophytic bacteria and plant rhizobacteria[J]. Prog. Nat. Sci., 2006，16(2):140-145.

Progress on Plant Endophyte

DING Wen-jun1, WANG Shan-shan1*, REN Jing-qi2, LI Ge1, ZHAN Jia-peng1

1.LifeEngineeringCollegeofShenyangInstituteofTechnology,LiaoningFushun113122,China;2.FushunVeterinaryDrugFeedMonitoringInstitute,LiaoningFushun113006,China

Plant endophyte is a kind of endophytic microorganism with high practical value. Plant endophyte is hard to detected for it not causing plant disease. With continuous research, more and more endophyte were found, the advantage of the active metabolites of its product also

more and more recognization. This paper reviewed the related progress on plant endophyte at home and abroad, including the discovery and history, diversity, physiological and biochemical characteristics of plant endophyte, and the relationship between plant endophyte and the host plants. The paper was expected to provided reference for related plant endophyte research.

plant; endophyte; antibacterial research

2015-06-04; 接受日期：2015-06-29

遼寧省教育科學(xué)規(guī)劃課題(JG14DB310)資助。

丁文珺，本科生，研究方向為微生物與細胞生物學(xué)。E-mail: parlindwj@163.com。*通信作者：王珊珊，講師,研究方向為生物化學(xué)與食品發(fā)酵。E-mail:shuihugai@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.04