韓 笑, 閆培生, 史翠娟, 楊樹燕, 李永鵬, 鄒雪平

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

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海洋微生物產(chǎn)纖維素酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展

韓 笑, 閆培生*, 史翠娟, 楊樹燕, 李永鵬, 鄒雪平

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

纖維素是地球上最古老、最豐富的天然高分子，是天然可再生資源。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)都能產(chǎn)生纖維素酶。微生物產(chǎn)纖維素酶已有較多報道，并在食品、醫(yī)藥、飼料、洗滌、紡織和造紙工業(yè)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。海洋是一個巨大的資源庫，海洋微生物產(chǎn)纖維素酶已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。對產(chǎn)纖維素酶海洋微生物的種群、來源及基因篩選、海洋微生物產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性，以及纖維素酶的應(yīng)用領(lǐng)域等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡要綜述，并對海洋微生物產(chǎn)纖維素酶的研究進(jìn)行了展望。

海洋微生物；纖維素酶；纖維素

纖維素是世界上最豐富的可再生天然有機資源，每年通過全球陸地生物合成可再生纖維素的總量約為560～1 200億t[1]，占植物界碳含量的50%以上。纖維素是一種復(fù)雜的多糖，由8 000～10 000個葡萄糖殘基通過β-1，4糖苷鍵連接而成。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還包括活力很高的木聚糖酶。只有各組分酶共同作用時才能將纖維素徹底水解為葡萄糖[2]。1906年，Seilliere首次在蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)了纖維素酶[3]，自此纖維素酶受到了廣泛關(guān)注。將天然纖維素降解為可利用的糖液，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酒精、菌體蛋白、氣體燃料如氫氣等物質(zhì)，對解決當(dāng)今世界所面臨的糧食短缺、能源危機和環(huán)境污染問題具有深遠(yuǎn)的意義[4]。從經(jīng)濟(jì)效益角度分析，在當(dāng)前的酶制劑領(lǐng)域中，纖維素酶是全球第三大工業(yè)酶制劑[5]。但纖維素酶的使用成本占酶糖化纖維材料總成本的25%～50%[6]，限制了纖維素酶在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，選育出高產(chǎn)、高酶活的菌株是亟待解決的問題。

海洋微生物資源豐富、生境獨特，從中能夠獲得豐富的纖維素酶種類，特別是極端酶。對極端酶加以改造，構(gòu)建高效工程菌株實現(xiàn)纖維素酶的高效表達(dá)，并能滿足工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的特殊條件要求，從而降低酶制劑的成本。因此，深入挖掘海洋微生物纖維素酶基因在提升纖維素酶效率方面潛力巨大，應(yīng)用前景廣闊，并且來源于海洋微生物的纖維素酶在實際應(yīng)用中的比例較低，尚有很大的可開發(fā)空間。

1 海洋微生物與產(chǎn)酶特性

海洋總面積約為3.6億km2，約占地球表面積的71%，海水下有多種地質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如海洋沉積物、洋殼、熱液口和冷泉等。這些多樣的地質(zhì)結(jié)構(gòu)孕育了豐富多彩的生命，構(gòu)成了最大的微生物生態(tài)系統(tǒng)[7]。

1.1 海洋微生物特性

與陸地相比，海洋環(huán)境以高鹽、高壓、低溫和稀營養(yǎng)為特征，海洋微生物想要生存就需要長期適應(yīng)獨特的海洋地質(zhì)結(jié)構(gòu)及海洋環(huán)境，這使得海洋微生物的生理結(jié)構(gòu)、代謝方式和生物行為都與陸生微生物有很大差異。

由于海水中鈉含量較高，海洋微生物最普遍的特點便是耐鹽性或嗜鹽性。海洋微生物還具有耐冷性或嗜冷性，大約90%的海洋環(huán)境溫度都在5℃以下，大多數(shù)海洋微生物的生長要求較低的溫度。當(dāng)然也存在著部分嗜熱性海洋微生物，這些海洋微生物生活在深海熱液口或火山口附近，洋殼中的流體在熱液口附近可被加熱到100～300℃(有的甚至達(dá)到400℃以上)后噴出[7]，使得此處的微生物具有嗜熱性。海洋微生物還具有嗜壓性，海水中靜壓力隨水深增加而增大，水深每增加10 m，靜水壓力遞增1個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，淺海微生物能忍耐較低壓力，深海微生物則能在高壓環(huán)境下生長并保持其酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性。除上述特性外，海洋微生物還有低營養(yǎng)、趨化性、附著生長、多形性和發(fā)光性等特點。

1.2 海洋微生物酶的特性

研究表明海洋微生物可以產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、多糖酶、溶菌酶、脂肪酶、木聚糖酶、氫化酶、谷氨酰胺酶和DNA聚合酶等[8]。海洋微生物需要適應(yīng)海洋中各種各樣的極端環(huán)境，也因此產(chǎn)生了一些有別于陸生微生物的具有特殊生理活性的酶。

在極端海洋環(huán)境中生長的微生物會產(chǎn)生特殊耐受性的極端酶，例如：耐冷菌和嗜冷菌會產(chǎn)生低溫酶，此類酶在低溫條件下仍具有較高活性，在應(yīng)用時不易受雜菌污染；嗜熱菌會產(chǎn)生在高溫100℃下仍可穩(wěn)定存在的酶；嗜壓菌可產(chǎn)生嗜壓酶，可解決在高壓下酶的化學(xué)鍵易被破壞、酶的構(gòu)象改變而失活的問題；嗜鹽菌可產(chǎn)生嗜鹽酶，此酶對鹽有極高的耐受性，可應(yīng)用在海產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域；利用海洋微生物還可產(chǎn)生耐酸或耐堿的極端酶[8]，在洗滌劑、食品等產(chǎn)業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

2 產(chǎn)纖維素酶的海洋微生物

已報道的產(chǎn)纖維素酶的微生物大多數(shù)為陸生微生物，極少有海洋微生物，深海微生物更加稀少。對海洋微生物纖維素酶的最早研究報道是來自海岸濕地紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的微生物[9]，后續(xù)的研究涉及的海域逐步擴(kuò)展，從極地到熱帶，從海水表面到海底都已經(jīng)有研究成果報道[10]。

2.1 胞外纖維素酶產(chǎn)生菌

在工業(yè)生產(chǎn)過程中，更希望得到的是擁有較高酶活的胞外酶，韓韞等[11]在廣東省汕尾鮑魚場采集的樣品中，分離篩選出兩株菌，初步鑒定為溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和溫和產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonassobria)，均可分泌胞外纖維素酶，其分解纖維素的酶活分別為10.3 U/mL和11.5 U/mL，降解能力很強。劉杰鳳等[12]從東海海底泥中分離得到一株海洋黑曲霉(AspergillusnigerZJUBE-1)，該菌株能在以纖維素為基質(zhì)的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生胞外纖維素酶酶系。

2.2 低溫纖維素酶產(chǎn)生菌

深海以及海冰、冰川海泥等提供了豐富的嗜冷菌資源，能夠篩選到有價值的低溫酶產(chǎn)生菌，近年來，許多學(xué)者開展了嗜冷纖維素酶的篩選研究。王玢等[13]從黃海的深海海底泥中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的海洋細(xì)菌，研究表明該菌種最適生長溫度為20℃，在0℃下也能生長，為嗜冷菌，該菌能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶，也能降解微晶纖維素，并且有淀粉酶活性，該纖維素酶最適反應(yīng)溫度為35℃，在10℃時仍有較高酶活，最適pH為6.0。劉軍等[14]從北極冰川海面下1 500～4 000 m處的海泥樣品中篩選出8株嗜冷細(xì)菌，其中菌株P(guān)371可產(chǎn)生纖維素酶。錢文佳等[15]從南極海冰細(xì)菌中篩選到產(chǎn)纖維素酶的交替假單胞菌Pseudoalteromonassp.545，該菌在0～10℃范圍內(nèi)均有較高產(chǎn)酶能力，所產(chǎn)纖維素酶最適作用溫度為35℃，在0～60℃范圍內(nèi)均有活性，pH 9.0時酶活最高，pH 6.0～10.0內(nèi)均有較高活性，由此可見該菌所產(chǎn)纖維素酶屬低溫堿性酶。

2.3 堿性纖維素酶產(chǎn)生菌

在海洋微生物纖維素酶的研究中還有很多學(xué)者關(guān)注于堿性纖維素酶。錢文佳等[15]篩選出的交替假單胞菌所產(chǎn)纖維素酶便是堿性酶。徐慶強等[16]從青島近海海域海水中分離篩選出一株耐冷菌，經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為噬纖維素菌Cytophagafucicola，所產(chǎn)纖維素酶在pH 9.0時具有最高酶活，在堿性條件下有較高酶活和較好穩(wěn)定性，同樣屬堿性纖維素酶。曲均革等[17,18]從寧波洋沙山和梅山島海域采集的樣品中通過2種途徑篩選出產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株，經(jīng)復(fù)篩得到一株高產(chǎn)堿性纖維素酶的海洋細(xì)菌，16S rDNA鑒定為交替假單胞菌屬，其產(chǎn)纖維素酶反應(yīng)的最適pH為9.0，pH 7.0～10.0范圍內(nèi)均有較高酶活。

2.4 耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌

部分海洋微生物能夠產(chǎn)生具有熱穩(wěn)定性的纖維素酶。Dipasquale等[19]從深海熱液口分離篩選出一株棲熱腔菌Thermosiphosp.strain 3，該菌厭氧嗜熱并且發(fā)酵產(chǎn)氫，經(jīng)16S rDNA分析，此菌與非洲棲熱腸菌(Thermosiphoafricanus)序列相似性達(dá)99.5%，可產(chǎn)生一種具有熱穩(wěn)定性的內(nèi)切纖維素酶，可水解羧甲基纖維素和β-葡聚糖，在pH 5.5、80℃時酶活最高，是典型的高溫條件下穩(wěn)定的纖維素酶。國內(nèi)對產(chǎn)耐熱纖維素酶的海洋微生物的報道較少，羅穎等[20]從東海溫泉的熱源地區(qū)采集的樣品中篩選出一株可在60℃下生長的菌種，經(jīng)鑒定將該菌命名為熱葡糖苷酶地芽胞桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)，該菌株兼性好氧，所產(chǎn)生耐熱性纖維素酶在45～60℃間表現(xiàn)較高酶活。

2.5 耐鹽纖維素酶產(chǎn)生菌

在很多方面比如造紙、治理海洋垃圾等需要耐鹽性的纖維素酶，薛棟升[21]從海洋中篩選出一株嗜鹽海洋黑曲霉(Aspergillusniger)，經(jīng)研究表明該菌所產(chǎn)的纖維素酶在12% NaCl溶液中酶活最大，是在無NaCl溶液中酶活的1.33倍，即使在24% NaCl下仍具有產(chǎn)酶能力[12]，是良好的耐鹽纖維素酶。產(chǎn)竹華等[22]從天津濱海、山東東營、江蘇連云港、福建廈門和海南三亞等地近海海域采集的樣品中分離篩選出的4株中度嗜鹽菌株均能夠產(chǎn)纖維素酶，通過搖瓶實驗，測定纖維素酶在高鹽條件下均具有較強酶活。目前，我國對耐鹽纖維素酶的研究有限，大多是對鹽堿地土壤樣品中的菌種進(jìn)行研究，對海洋來源的耐鹽纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選少之又少，有著極大的發(fā)展空間。

3 海洋來源的纖維素酶基因工程

盡管纖維素酶系中的某些基因已克隆并在受體菌中得到表達(dá)，但仍需要進(jìn)一步開發(fā)具有高產(chǎn)酶活性的高效菌株，以及構(gòu)建同時具備多種特性以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件的工程菌株。從海洋環(huán)境篩選到的纖維素酶種類豐富，同時兼具多種特性較易實現(xiàn)在工業(yè)中的應(yīng)用(如低溫堿性酶等)，因此海洋微生物纖維素酶為構(gòu)建高酶活性、高產(chǎn)酶量的工程菌株奠定了基礎(chǔ)。游銀偉等[23]從黃海深海海底泥中分離篩選出一株交替假單胞菌Pseudoalteromonassp.MB-1，并對其適冷內(nèi)切葡聚糖酶基因celA進(jìn)行克隆，獲得重組質(zhì)粒pGEX-celA，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后得到融合蛋白GST-CelA，經(jīng)分析測定，此融合蛋白最適反應(yīng)溫度為35℃，最適pH為7.2，是一種中性適冷酶。李相前等[24]對海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)極耐熱胞外酶Cel12B和木聚糖酶XynA CBD結(jié)構(gòu)域基因融合，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-20b-Cel12B-CBD，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，對結(jié)晶纖維素有水解活性，酶反應(yīng)最適溫度為100℃，最適pH為5.8，屬極耐熱酶。董俊麗[25]篩選分離出有纖維素酶活性的深海細(xì)菌Martelellamediterranea，序列對比顯示該菌株與M.mediterraneastrain 2PR511-4同源性達(dá)100%。將其纖維素酶基因cel5D基因克隆到表達(dá)載體pGEX-6P-1上，使重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，該基因所產(chǎn)酶經(jīng)純化后在60℃和pH 5.0時活性最高，在60℃以下，pH 3.0～11.0時酶活性較穩(wěn)定。

4 海洋纖維素酶的應(yīng)用前景

纖維素酶是生物體產(chǎn)生的活性物質(zhì)，可以安全、高效、無污染地降解纖維素，這是其他方法無法比擬的，特別是在能源短缺、污染嚴(yán)重的現(xiàn)實情況下，纖維素酶的深入開發(fā)利用已經(jīng)引起了全世界的關(guān)注[26]。隨著研究的不斷深入，纖維素酶的應(yīng)用也逐步拓展，在食品、飼料、造紙、紡織、中草藥的提取、能源和洗滌等領(lǐng)域均發(fā)揮著舉足輕重的作用。海洋纖維素酶的極端耐受性等特性使其可以很好的應(yīng)用于上述工業(yè)領(lǐng)域。

4.1 洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用

堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。堿性纖維素酶一般不能作用于結(jié)晶纖維素，不受去污劑及其他添加劑影響。90%的污染物附著在棉纖維之間，堿性纖維素酶作用于非結(jié)晶區(qū)，能有效地軟化、水解纖維素分子與水、污垢結(jié)合形成的凝膠狀結(jié)構(gòu)[27]，使污垢洗脫出來，且棉麻織物的強度和表觀聚合度不會發(fā)生顯著改變[28]。堿性纖維素酶能很好地適應(yīng)洗滌劑的堿性條件。

4.2 食品工業(yè)中的應(yīng)用

4.2.1 醬油釀造 醬油是一種富有營養(yǎng)的調(diào)味品，按發(fā)酵工藝可分為兩類，高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油，在醬油發(fā)酵過程中食鹽是必不可少的原料之一，鹽度會直接影響釀造過程中使用的酶制劑的活性[29]。醬油的天然釀造過程中需要加入淀粉酶、蛋白酶等多種酶[30]，在酶解過程中適當(dāng)?shù)丶尤肽望}纖維素酶，可以使大豆等原料的細(xì)胞膜軟化、膨脹，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)釋放，縮短釀造時間，提高產(chǎn)率和產(chǎn)品品質(zhì)[31]。

4.2.2 果蔬加工 在果蔬加工過程中，常采用加熱蒸煮和酸堿處理等方法使植物組織快速軟化和膨潤，這樣會破壞果蔬的香味并損失營養(yǎng)物質(zhì)[31]。在果蔬加工過程中用纖維素酶進(jìn)行適當(dāng)處理，可以使植物組織軟化，改善口感，簡化工藝。近年來，冷凍干燥技術(shù)已成功應(yīng)用于制備脫水蔬菜的過程中，在制備脫水蔬菜過程中用低溫纖維素酶進(jìn)行適當(dāng)處理后再干燥脫水，可改進(jìn)脫水蔬菜的復(fù)原性并且能夠避免蔬菜中維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的過度流失。

纖維素酶還可應(yīng)用于啤酒糖化、白酒釀造、大豆加工和飲用品加工等過程中[31]。

4.3 生物能源中的應(yīng)用

21世紀(jì)是能源競爭最為激烈的世紀(jì)，世界各國都在爭取現(xiàn)有能源的同時大力開發(fā)新能源。美國早在20世紀(jì)就已經(jīng)認(rèn)識到乙醇燃料的優(yōu)勢，強制在燃料中添加10%的乙醇[32]。劉羽[33]從南極菌株產(chǎn)物中分離純化得到低溫纖維素酶，同步糖化發(fā)酵實驗結(jié)果表明該低溫纖維素酶可降解纖維素產(chǎn)生乙醇，其低溫特性能有效解決同步糖化發(fā)酵過程中酵母生長溫度與纖維素酶最適酶活溫度不一致的問題。高叢[34]篩選出產(chǎn)纖維素酶南極菌株后獲得低溫纖維素酶，該低溫纖維素酶可將海帶纖維素降解成可被酵母菌發(fā)酵利用的單糖并用于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，為制備纖維素乙醇開發(fā)了新型、充足且廉價的原料。纖維素酶除可以用來制備燃料乙醇，還可發(fā)酵制沼氣。李亞冰[35]用從兼性厭氧菌株中得到的纖維素酶以秸稈為原料成功進(jìn)行了沼氣發(fā)酵。

5 展望

纖維素是地球上最大的可再生資源庫，天然存在的纖維素大多被微生物所降解，沒有得到充分利用，這是極大的資源浪費，如何能充分利用這個巨大的資源庫是值得關(guān)注的重點。纖維素有多種分解方法，但最有效的方法莫過于生物降解。至今，已有大量纖維素酶的研究成果，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以滿足需求。產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選雖已取得一定進(jìn)展，但尚不能很好地滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，因此，獲得高酶活的高產(chǎn)纖維素酶菌種仍是今后需重點解決的問題。目前多數(shù)報道是從陸生微生物中篩選出產(chǎn)纖維素酶的菌種，大多不能在工業(yè)生產(chǎn)的特殊條件下保持高酶活性和穩(wěn)定性。隨著研究人員更多的將目光投向海洋，未來將會有海洋微生物纖維素酶真正實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。然而要實現(xiàn)這一愿景，還需要在海洋微生物極端環(huán)境耐受性機理上開展深入研究，從微生物代謝途徑方向?qū)Ξa(chǎn)酶機制進(jìn)行研究，以及在利用高通量的定向進(jìn)化等技術(shù)獲得性能更穩(wěn)定、更優(yōu)良的纖維素酶產(chǎn)生菌方面開展研究。

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Research Progress on Cellulase Producing by Marine Microorganisms and its Application

HAN Xiao,YAN Pei-sheng*,SHI Cui-juan,YANG Shu-yan,LI Yong-peng,ZOU Xue-ping

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

Cellulose is the most ancient，abundant and inexhaustible natural polymer resources.Cellulase widely exists in the organism including bacteria，fungi and animals.Microbial cellulase has been widely reported and utilized in industries of food， medicine， feed， detergent， textile， pulp and paper，etc..The ocean is a huge pool of resources，and cellulose-producing marine microorganisms have attracted a lot of attention.This paper briefly summarized the research progress of populations and source of marine microorganisms producing cellulase and genetic screening，the enzymatic properties and application fields of cellulase produced by marine microorganisms.Prospects of study on marine microbial cellulase were also discussed.

marine microorganisms; cellulase; cellulose

2015-04-22; 接受日期：2015-05-07

中國大洋協(xié)會國際海域資源調(diào)查與開發(fā)“十二五”重大項目(DY125-15-R-01)；哈爾濱工業(yè)大學(xué)優(yōu)秀團(tuán)隊支持計劃資助。

韓笑，本科生，主要從事食品科學(xué)與工程研究。E-mail：1243966565@qq.com。*通信作者：閆培生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為海洋微生物資源與利用、海洋生物質(zhì)及其加工廢物的高值資源化、有害微生物的生物防治與生物農(nóng)藥、微生物發(fā)酵工程與生物制藥等。E-mail: yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.07