黃 靜,顏海鋒,鄭 燕
(1.國家菌草工程技術(shù)中心,福建 福州350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州350002)
巨菌草(Pennisetum sp.)原產(chǎn)于北非地區(qū),1983年引入中國,是一種單子葉禾本科狼尾草屬植物。莖直立,叢生,根系非常發(fā)達(dá),植株高大,一般為3~5 m,最高的可達(dá)7.08 m。巨菌草喜溫暖濕潤條件,適宜在亞熱帶、熱帶和溫帶生長;屬于C4植物,具有很高的光合效率,抗逆性很強(qiáng),產(chǎn)量很高,達(dá)300~500 t·h m-2[1-2]。近幾年,巨菌草在我國南方地區(qū)的種植面積逐步擴(kuò)大,應(yīng)用也越來越廣泛,除了作為動(dòng)物飼料和保持水土的優(yōu)良品種[3],也用作栽培靈芝和平菇、猴頭菇等食用菌的培養(yǎng)料[4]。此外,還可用作生物能源,用于生物發(fā)電和制造燃料[5-6]。
然而,巨菌草不耐寒,在北方寒冷地區(qū)自然難以越冬。我國北方大部分地區(qū)通過扦插進(jìn)行無性繁殖;也可用種子進(jìn)行有性繁殖,但發(fā)芽率很低[7],如遇冰雪和霜凍天氣很容易死亡,這種特性使其在北方地區(qū)的推廣嚴(yán)重受到限制,傳統(tǒng)的育種技術(shù)無法解決此難題。生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因、體細(xì)胞雜交等是改良巨菌草耐寒性的有效途徑,但必須首先建立巨菌草的組織培養(yǎng)技術(shù)體系及轉(zhuǎn)基因體系。而有關(guān)巨菌草組織培養(yǎng)方面的研究在國內(nèi)外尚沒有相關(guān)的報(bào)道?;诖耍狙芯恳跃蘧莸那o尖分生組織作為外植體,對巨菌草的愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行探索,以期為巨菌草組織培養(yǎng)體系建立和生物技術(shù)遺傳改良奠定基礎(chǔ),同時(shí)為巨菌草的組培育苗提供技術(shù)支持,促進(jìn)在更大范圍利用和推廣巨菌草。
試驗(yàn)材料為巨菌草幼莖,在福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)中心菌草種植基地種植,由于巨菌草不斷地分蘗,可隨時(shí)取到比較幼嫩的莖。
1.2.1 外植體準(zhǔn)備 選取幼嫩且生長良好的巨菌草莖桿,剝除葉鞘,用刀切下莖尖部分[8-9]。
1.2.2 培養(yǎng)基的制備 以MS+30 mg·L-1蔗糖+2.5 mg·L-1植物膠+1 mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮為基本培養(yǎng)基,p H 為5.8。
1.2.3 外植體的消毒接種 將外植體分別置于75%的乙醇中處理0、30、60 s和2%的次氯酸鈉溶液中處理10、15、20 min,用無菌水沖洗3~5次,在無菌濾紙上吸干水分,用手術(shù)刀切成0.1~0.2 c m厚的小薄片,接種于MS基本培養(yǎng)基上,每瓶接種6塊外植體,每次接種6瓶,3次重復(fù)。然后置于26~28 ℃的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng),7 d 后統(tǒng)計(jì)外植體污染率[10-11]。
1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)
1)將外植體材料接種含2,4-D 濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1的MS 培養(yǎng)基中,觀察愈傷組織生長狀況,選取愈傷組織生長最好的濃度為最佳濃度[12-14]。
2)在最佳2,4-D 濃度的基礎(chǔ)上,在MS培養(yǎng)基中添加0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1的NAA 或IAA與2,4-D 組合,選擇愈傷組織生長最好的濃度組合[15-16]。
3)在最佳2,4-D 和最佳IAA 或NAA 的濃度組合上,在MS 培養(yǎng)基上添加0.5、1.0、1.5 mg·L-1細(xì)胞分裂素6-BA 或KT,選擇愈傷組織生長最好的濃度組合。
以上各階段愈傷組織的誘導(dǎo)均在暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為26~28 ℃[15],每個(gè)處理接種6瓶,每瓶接種4~6塊外植體,3次重復(fù)(即重復(fù)18瓶),接種20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。
愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體/接種的外植體總數(shù)×100%。
以上各處理的3 次重復(fù)數(shù)據(jù)平均值為結(jié)果數(shù)據(jù),運(yùn)用Excel 2010和統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性測驗(yàn)和分析。
該組處理編號為A1到A11,共11種組合,結(jié)果如表1所示。
外植體的污染率在0~28%,最低的為只用次氯酸鈉消毒10、20 min和只用乙醇30、60 s,污染率都為0。污染率最高的為用乙醇消毒30 s然后再用次氯酸鈉消毒20 min,污染率為28%。
表1 不同消毒劑對外植體處理不同時(shí)間后的污染情況Table 1 Contamination r ate of explants after disinfecting by different disinfectants with different ti mes
表2 不同濃度的2,4-D對巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Different concentrations of 2,4-D effects on Pennisetum sp.callus induction
與不加入2,4-D 的對照相比(表2),不同濃度的2,4-D 均能誘導(dǎo)出巨菌草的愈傷組織(圖1)。從1.0~4.0 mg·L-14個(gè)濃度梯度中,巨菌草的出愈率并沒有顯著差異,在51.000%~56.000%。
圖1 巨菌草莖尖的愈傷組織Fig.1 Pennisetum sp.stem tip callus
以MS+3.0 mg·L-12,4-D 作為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的IAA 和NAA,以不添加生長素為對照,共9個(gè)處理(表3)。
與對照相比,加入IAA 或NAA 之后,巨菌草的出愈率均有明顯的提高,除C5 外其余處理與對照間差異均極顯著(P<0.01)(表3)。出愈率隨著IAA 濃度的增高而呈先升高再降低的趨勢,在濃度為0.2 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高水平,此時(shí)出愈率為76%,與其他濃度間差異極顯著。而4 個(gè)濃度的NAA均能增加出愈率,但無顯著差異(P>0.05),
以MS作為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的2,4-D,以不添加2,4-D 作為對照(CK),共5 個(gè)處理,結(jié)果如表2所示。出愈率都在60%左右。
表3 不同濃度的IAA、NAA與2,4-D組合對巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Influence of different concentrations combination of IAA,NAA and 2,4-D on Pennisetum sp.callus induction
以MS+3.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-1IAA 為基本培養(yǎng)基(記為D),添加不同濃度的細(xì)胞分裂素,6-BA 或KT,以不添加細(xì)胞分裂素為對照,共有7個(gè)處理組合(表4)。
不加細(xì)胞分裂素的對照組出愈率為68%,加入細(xì)胞分裂素之后,出愈率為66.000%~71.000%,與對照相比差異不顯著(P>0.05)。
表4 不同濃度細(xì)胞分裂素對巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tabel 4 Effects of different concentration of cytokinin on Pennisetum sp.callus induction
在植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)中,外植體消毒是試驗(yàn)的第一步也是很關(guān)鍵的一步,如果消毒處理效果不好,將會(huì)產(chǎn)生大范圍的污染,導(dǎo)致以后的步驟無法繼續(xù)進(jìn)行[17]。然而,影響消毒效果的因素很復(fù)雜,所以污染是普遍發(fā)生的問題。由于外植體比較幼嫩,酒精穿透力又很強(qiáng),所以用酒精造成的褐化比較嚴(yán)重,導(dǎo)致外植體活力大大降低[8]。對外植體用不同的消毒劑組合及不同時(shí)間處理后發(fā)現(xiàn),只用2%次氯酸鈉或只用75%酒精處理外植體的效果最好,沒有發(fā)現(xiàn)污染情況,但是用75%的酒精處理后褐化會(huì)非常嚴(yán)重,導(dǎo)致外植體的生長活力不強(qiáng)。如果用酒精處理后再用次氯酸鈉處理染菌率反而增高,可能是出現(xiàn)交叉污染的狀況,這與謝妤和張子雯[10]對雜交狼尾草(Pennisetu m al opecuroides)的研究結(jié)果一致的。由于本研究中用的外植體都是非常幼嫩的莖,酒精和次氯酸鈉都會(huì)在一定程度上損害外植體,所以在保證無污染的情況下,消毒劑的處理時(shí)間越短越好。鑒于本研究的材料為有很多帶絨毛的葉鞘,為了盡量降低污染率,又保持外植體較高的活力,先用75%酒精擦拭剝除較老的葉鞘,然后用2%的次氯酸鈉溶液消毒處理10 min,從而達(dá)到了理想的消毒效果。
在甘蔗(Sacchar um)組織培養(yǎng)試驗(yàn)中,2,4-D被認(rèn)為是外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的關(guān)鍵因素[15]。在不含2,4-D 的培養(yǎng)基中,甘蔗外植體不能脫分化產(chǎn)生愈傷組織,這與本研究巨菌草愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果是一致的。但是巨菌草誘導(dǎo)愈傷組織對濃度要求不高,2,4-D 濃度在1.0~4.0 mg·L-1的范圍內(nèi)都可以誘導(dǎo)出愈傷組織,且各濃度間差異不顯著。由于前人對禾本科的組織培養(yǎng)結(jié)果都表明3.0 mg·L-1的2,4-D 是最佳濃度[16,18],3.0 mg·L-1的2,4-D 也是誘導(dǎo)絨毛狼尾草(Pennisetu m setaceum )幼穗愈傷組織的最適濃度[12],此外,本研究中雖然各個(gè)濃度2,4-D 都能誘導(dǎo)出愈傷組織,且出愈率差異不顯著,但從愈傷組織的硬度和顏色看,3.0 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)的愈傷組織長勢最好,故本研究中采用3.0 mg·L-1為最佳濃度。
生長素NAA 和IAA 都能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo),但是濃度對其的影響差別相對比較大;雖然二者的影響均達(dá)到顯著水平,但是IAA 比NAA 的效果更好,且在濃度為0.2 mg·L-1時(shí)能發(fā)揮最好的效果,誘導(dǎo)率高達(dá)76%。在甘蔗組織培養(yǎng)中,細(xì)胞分裂素KT 和6-BA 也能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)[15]。對象草(Pennisetu m pur pureu m)幼穗的研究表明,KT 濃度為0.05 mg·L-1或0.10 mg·L-1時(shí),顆粒狀愈傷組織的誘導(dǎo)率較高[19]。但是在本研究中,這兩種細(xì)胞分裂素的效果不是很明顯,所以在巨菌草的愈傷組織誘導(dǎo)中沒有必要加入KT 或6-BA。
綜上,巨菌草的組織培養(yǎng)體系與其他禾本科植物存在一定差異。巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是MS+2,4-D(3.0 mg·L-1)+I(xiàn)AA(0.2 mg·L-1)。
巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)中關(guān)鍵的一步,愈傷組織誘導(dǎo)的成功對于組織培養(yǎng)或體細(xì)胞雜交,甚至轉(zhuǎn)基因在巨菌草上的應(yīng)用都具有重要的意義。因此,在本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對其愈傷組織分化成苗的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,為推廣巨菌草提供更多的技術(shù)支持。
[1] 丁銘,白璐,王龍清.巨菌草引進(jìn)試驗(yàn)及栽培種植技術(shù)[J].農(nóng)村科技,2013(12):60-61.
[2] 李志文.巨菌草作為能源草的特性研究[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(新能源產(chǎn)業(yè)),2013(6):12-15.
[3] 鄭金英,陳麗鳳,林占禧.菌草產(chǎn)業(yè)成長及其多功能性探析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(1):304-308.
[4] 董曉娜,陳喜蓉,鐘劍鋒,林芳能,陽記萍.巨菌草栽培靈芝試驗(yàn)初探[J].林業(yè)科技,2013,41(1):39-40.
[5] 林興生,林占熺,林冬梅,林輝,羅海凌,胡應(yīng)平,林春梅,朱朝枝.菌草作為生物質(zhì)燃料的初步研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào),2013,33(1):82-86.
[6] 邱世海,韋立新,席春燕,劉潔,黃煥耀,章超,江日德.生物質(zhì)發(fā)電廠燃料適用預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀[J].輕工科技,2012(5):102-104.
[7] 黃國勇.應(yīng)用菌草技術(shù)治理寧夏荒漠化土地的研究與展望[J].防護(hù)林科技,2011(2):46-48.
[8] 曹孜義,劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州:甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,1996.
[9] 王憑青,段傳人,王伯初,周興龍,謝偉偉.雜交狼尾草不同外植體材料組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,28(6):118-120.
[10] 謝妤,張子雯.雜交狼尾草離體培養(yǎng)植株再生體系的建立[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào),2012,34(12):97-99.
[11] 趙麗君,王雪芳,張金林,王鎖民.植物組織培養(yǎng)及其在草類植物中的研究和應(yīng)用[J].草業(yè)科學(xué),2011,28(6):1140-1148.
[12] 繆珊,范繼紅.絨毛狼尾草幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,38(2):255-258.
[13] Mythili P K,Satyavathi V,Pavanku mar G.Genetic analysis of short ter m callus culture and mor phogenesis in pearl millet,Pennisetum gl aucum[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1997,50:171-178.
[14] Morrish E M,Hanna W W,Vasil I K.The expression and per petuation of inherent so matic variation in regenerants fro m embryogenic cultures of Pennisetu m gl aucu m (L.)R.Br.(pearl millet)[J].Theoretical and Applied Genetics,1990,80:409-416.
[15] 楊燕妮.甘蔗離體培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)——誘導(dǎo)與分化研究[D].南寧:廣西大學(xué)碩士論文,2011.
[16] 張曉瑩,張瀚儷,牟彤,龔束芳.外源激素對紫穗狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響[J].草業(yè)科學(xué),2012,29(7):1066-1071.
[17] 朱廣廉.植株組織培養(yǎng)中的外植體滅菌[J].植物生理學(xué)通訊,1996,32(6):444-449.
[18] 楊燕妮.甘蔗離體培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)與分化研究[D].廣西:廣西大學(xué)碩士論文,2011:5-36.
[19] 鐘小仙,佘建明,顧洪如,張建麗,倪萬潮.象草幼穗離體培養(yǎng)植株再生研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(3):43-48.