劉建利，李彥忠

（1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；

2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川750021；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010）

沙打旺（Astr agal us adsur gens）是豆科（Leguminosae）黃芪屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，因其抵御風(fēng)沙能力強(qiáng)而得到“沙大王”的美譽(yù)。目前，制約沙打旺大面積種植的最主要原因是沙打旺埃里磚格孢（Embellisia astr agali）引起的黃矮根腐病，該病害是造成沙打旺草地退化最嚴(yán)重的病害之一［1］，該病屬系統(tǒng)性病害，嚴(yán)重威脅沙打旺草地的生產(chǎn)力、使用壽命、草品質(zhì)及種子產(chǎn)量［2］。植物病原真菌與宿主植物之間信號(hào)識(shí)別及傳導(dǎo)，在病害發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，因此，病原真菌與植物互作過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其調(diào)控已成為分子植物病理學(xué)研究的熱點(diǎn)。鈣調(diào)素是鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)通路中重要的分子，研究表明，鈣調(diào)素參與調(diào)控許多植物病原真菌的交配、細(xì)胞分化、有絲分裂、致病性、分生孢子形成及萌發(fā)、色素合成、毒素的產(chǎn)生以及侵染過(guò)程［3］。到目前為止，綠僵菌（Metar hizin m anisopliae）［4］、苜蓿炭疽菌（Colletotrichu m medicaginis）［5］、巴 西 副 球 孢 子 菌（Par acoccidioides br asiliensis）［6］、埃默森小芽枝霉（Bl astocl adiell a emersonii）［7］、構(gòu)巢曲霉（Asper gill us nidul ans）［8］、白假絲酵母（Candida albieans）［9］、盤(pán)基網(wǎng)柄菌（Dictyosteliu m discoideu m）［10］、致病疫霉（Phytophthor a inf estans）［11］、脈 胞 霉（Neurospor a cr assa）［12］、米曲霉（Asper gill us or yzae）［13］、莢膜組織孢漿菌（Histopl asma capsul atum）［14］、三 葉 草 刺 盤(pán) 孢 菌（Colletotrichu m trif olii）［15］、盤(pán) 長(zhǎng) 孢 狀 刺 盤(pán) 孢 菌（Colletotrichum gloeosporioides）［16］、稻 瘟 病 菌（Magaporthe grisea）［17］等許多真菌鈣調(diào)素編碼基因已被克隆。本研究旨在從沙打旺埃里磚格孢中克隆鈣調(diào)素編碼基因序列，為研究其在致病中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙打旺黃矮根腐病菌株E.astr agali NHLZU0408來(lái)自于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)所。

主要試劑有E.Z.N.A Fungal DNA Mini Kit（美國(guó)Omega Bio－Tek，Inc.公 司），Pure Plasmid Mini Kit（康為世紀(jì)生物科技有限公司），Ultrapure RNA Kit超純RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司），高保真酶Pri mer STAR＠HS（Per－mix）［寶生物工程（大連）有限公司］TransScriptⅡOne－Step g DNA Removal and c DNA Synt hesis Super Mix，PCR Super Mix，T 載體、Blunt－T 載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司），其他試劑購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器

PCR 儀（S1000型，Bio－Rad公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3 K30型，Sig ma公司），空氣浴恒溫?fù)u床（HZ－9210 K 型，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），電子天平（FA2104B，上海精密科學(xué)儀器有限公司），電泳系統(tǒng)（DYY－21型，北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR 型號(hào)，美國(guó)Bio－Rad公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA、總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 將真菌接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d，過(guò)濾菌絲體后，置于研缽中加液氮研磨后，DNA 提取步驟按照E.Z.N.A Fungal DNA Mini Kit提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA 提取步驟按照Ultrapure RNA Kit超純RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄TransScriptⅡOne－Step g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 鈣調(diào)素基因同源片段克隆 簡(jiǎn)并引物［18］：

CAL－228F，5′－GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC－3′；CAL－737R，5′－CATCTTTCTGGCCATCATGG －3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系組成：2×PCR Super Mix（Mg2＋plus）10 μL，引物（10μmol·L－1）各1μL，DNA 模板1μL，水補(bǔ)足使總體積為20μL。PCR 條件參考Pryor和Bigelow［18］，擴(kuò)增產(chǎn)物連接T 載體，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.3 5′端和3′端的克隆

5′Hi－TAIL PCR 特 異 性 引 物 SPCa M51：ATCTCCGGCCCACGCAATCGGCAAAG；SPCa M52：ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACAACACC ACGACATGCACCGCACTC；SPCa M53：CGACAACAACGGCACCATTGACTTCCC；

3′Hi－TAIL PCR 特 異 性 引 物 SPCa M31：ATCTCCGGCCCACGCAATCGGCAAAG；SPCa M32：ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACAACACCAACATGCACCGCACTC；SPCa M33：CGACAACAACGGCACCATTGACTTCCC；Hi－TAIL PCR 隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（LAD系列）和3輪PCR條件參照Liu等［19］的方法。

1.3.4 鈣調(diào)素基因全長(zhǎng)的克隆

全長(zhǎng)引物 Ca MF：AACACGACAGCCTGCCCACC；Ca MR：CGTCACTCGTCGCCGTTA

以1μL總DNA、c DNA 為模板，PCR 反應(yīng)體系組成：2×Pri mer STAR?HS（Per mix）10μL，引物（10μmol·L－1）各1μL，模板1μL，水補(bǔ)足使總體積為20μL。PCR 條件94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 保守片段克隆

以基因組DNA 為模板，采用CAL－228F／CAL－737R引物，PCR擴(kuò)增獲得約539 bp片段（圖1），測(cè)序后BLAST比對(duì)結(jié)果顯示為鈣調(diào)素基因部分片段。

圖1 用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因部分同源片段電泳圖Fig.1 Result of cal modulin part conservative sequence of E.astr agali using degenerate PCR

2.2 5′端片段和3′端片段的克隆

采用Hi－TAIL PCR 技術(shù)分別克隆沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因5′端和3′端片段，經(jīng)過(guò)3 輪PCR，LAD1～LAD5所有5個(gè)隨機(jī)引物菌擴(kuò)增出條帶，5′端 部 分 片 段 取LAD3 的 第3 輪PCR 擴(kuò) 增 的300－400 bp產(chǎn)物回收測(cè)序，獲得344 bp序列（圖2），含特異性引物位點(diǎn)，其前面部分序列也與同源片段中序列一致，BLAST 比對(duì)后與其他物種鈣調(diào)素基因高度一致；3′端部分片段取LAD3 的第3 輪PCR 約700～800 bp產(chǎn)物回收測(cè)序，獲得729 bp序列（圖2），含特異性引物位點(diǎn)，其后面部分序列也與同源片段中序列一致，BLAST 比對(duì)后與Gen Bank中其他物種鈣調(diào)素基因高度一致。

圖2 Hi－TAIL技術(shù)克隆沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因5′和3′端部分片段電泳圖Fig.2 Result of agarose gel－ectrophoresis of cal modulin 5′and 3′part sequence of E.astr agali using Hi－TAIL PCR

2.3 全長(zhǎng)基因克隆

將保守片段、5′端片段和3′端片段電子拼接，獲得1 290 bp長(zhǎng)度片段，其中編碼區(qū)840 bp。設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，以基因組DNA 和c DNA 為模板，擴(kuò)增獲得沙打旺黃矮根腐病菌DNA 和c DNA 編碼區(qū)全長(zhǎng)，測(cè)序，獲得840 bp的DNA 和450 bp的c DNA 編碼區(qū)全長(zhǎng)序列（圖3），與電子拼接結(jié)果一致，BLAST比對(duì)后與Gen Bank中其他物種鈣調(diào)素基因高度一致。DNA 全長(zhǎng)序列中包括4個(gè)內(nèi)含子，均符合GTAG 規(guī)則（圖4）。c DNA 編碼序列翻譯149個(gè)氨基酸的多肽，BLAST 比對(duì)也與SWISS－PROT 中其他物種鈣調(diào)素蛋白序列高度一致。

圖3 黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因DNA和c DNA全長(zhǎng)序列克隆電泳圖Fig.3 Result of cal modulin DNA complete coding sequence of E.astr agali

圖4 沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素DNA和c DNA編碼基因比對(duì)圖Fig.4 Align ment of cal modulin DNA and c DNA sequence of E.astr agali

3 討論

常規(guī)克隆基因的方法是從c DNA 到DNA，即先以mRNA 反轉(zhuǎn)錄的c DNA 為模板，利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得目的基因部分區(qū)段，然后利用RACE 技術(shù)獲得5′端和3′端序列，最后拼接全長(zhǎng)，再設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物分別以c DNA 和DNA 為模板擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)c DNA 序列和DNA 序列。該方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于c DNA 末端快速擴(kuò)增（Rapid Amplification of c DNA Ends，RACE）技術(shù)，試劑盒費(fèi)用高，對(duì)mRNA質(zhì)量要求也較高，費(fèi)時(shí)，技術(shù)難度也大。Hi－TAIL PCR 技術(shù)是一種根據(jù)已知序列基因獲得其側(cè)翼序列的基因組步移新技術(shù)，以DNA 為模板，需4～5條通用引物和2～3條特異引物，3 輪PCR 即可獲得結(jié)果，1 d可獲得試驗(yàn)結(jié)果，已被廣泛用于克隆啟動(dòng)子或探知T－DNA 突變體插入位點(diǎn)。既然Hi－TAIL PCR 是一種從已知序列獲得近旁未知序列的方法，從理論上分析，Hi－TAIL PCR 技術(shù)可以用于植物病原真菌基因的克?。?0－21］。本研究在得到同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，成功利用Hi－TAIL PCR 技術(shù)克隆到沙打旺黃矮根腐病鈣調(diào)素編碼基因全長(zhǎng)，證明Hi－TAIL PCR 技術(shù)可以用于植物病原真菌基因克隆。相比較RACE技術(shù)，其以DNA 為模板，最大的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低，在已知片段GC 含量較高的時(shí)候，成功機(jī)率尤為高。

對(duì)鈣調(diào)素參與真菌致病性調(diào)控研究已進(jìn)行了多年。最早研究者用鈣調(diào)素特異性抑制劑阻斷信號(hào)通路試驗(yàn)推測(cè)鈣調(diào)素參與真菌致病性調(diào)控，例如，鈣調(diào)素參與玉米小斑菌（Cochliobol us heterostrophus）［22］、稻梨孢（Magnaporthe grisea）［23］、盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢菌［24］、三葉草刺盤(pán)孢菌［15］、桃褐腐病菌（Monilinia f r ucticol a）［25］、水稻胡麻斑菌（Cochliobol us miyabeanus）［26］、膠孢炭疽菌（Colletotrichu m gloeosporioides）［27］附著胞的形成；鈣調(diào)素抑制白假絲酵母由Y 型（yeast）向M 型（myceliu m）的形態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程［28］；鈣調(diào)素參與尾孢菌（Cercospor a nicotianae）［29］毒素的合成。近年來(lái)，采用反向遺傳學(xué)和正向遺傳學(xué)手段對(duì)鈣調(diào)素參與調(diào)控的研究也陸續(xù)展開(kāi)。2000年，War war等［30］通過(guò)反義表達(dá)技術(shù)（Antisense Expression）也證實(shí)，鈣調(diào)素基因參與稻梨孢和盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢附著胞的形成。2005 年，Kraus等［17］利用一個(gè) 新型隱球菌（Cr y ptococcus neof or mans）鈣調(diào)素插入突變體，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)素調(diào)控新型隱球菌形態(tài)構(gòu)建和溫度適應(yīng)性及致病性。Liu和Kolattukudy［31］、St Leger等［4］把鈣調(diào)素基因啟動(dòng)子與GFP構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)到其稻梨孢基因組中，發(fā)現(xiàn)隨附著胞的不斷形成，鈣調(diào)素基因的表達(dá)量迅速增加。Dick man等［5］利用鈣調(diào)素特異性探針或引物，發(fā)現(xiàn)抑制鈣調(diào)素基因的表達(dá)，苜蓿炭疽仍能形成附著胞，但會(huì)使形成率降低。這些研究結(jié)果都表明，鈣調(diào)素參與了病原真菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)、附著胞形成或致病性的調(diào)控等。下一步將采用基因敲除或RNAi技術(shù)研究鈣調(diào)素對(duì)沙打旺黃矮根腐病菌生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝及致病性的調(diào)控。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

［1］ Li Y Z，Nan Z B.A new species，Embellisia astr agali sp.nov.，causing standing milk－vetch disease in China［J］.Mycologia，2007，99（3）：406－411.

［2］ Li Y Z，Nan Z B，Hou F J.The roles of an Embellisia sp.causing yellow stunt and root rot of Astragal us adsur gens and other f ungi in the decline of legu me pastures in norther n China［J］.Australasian Plant Pathology，2007，36（4）：397－402.

［3］ Lengeler K B，Davidson R C，D’souza C，Harashi ma T，Shen W C，Wang P，Pan X，Waugh M，Heit man J.Signal transduction cascades regulating f ungal develop ment and vir ulence［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2000，64（4）：746－785.

［4］ St Leger R J，Roberts D W，Staples R C.Calcium and cal modulin－mediated protein synthesis and protein phosphorylation during ger mination，growth and protease production by Metar hizium anisopliae［J］.Journal of General Microbiology，1989，135（8）：2141－2154.

［5］ Dick man M B，Buhr T，War war V，Tr uesdell G，Huang C.Molecular signals during the early stages of alfalfa ant hracnose［J］.Canadian Jour nal of Botany，1995，73（S1）：1169－1177.

［6］ de Car valho M J A，Amori m Jesuino R S，Daher B S，Silva－Pereira I，de Freitas S M，Soares C，F(xiàn)elipe M S S.Functional and genetic characterization of cal modulin fro m t he di mor phic and pathogenic f ungus Par acoccidioides br asiliensis［J］.Fungal Genetics and Biology，2003，39（3）：204－210.

［7］ Si m?o R d C G，Go mes S L.Str ucture，expression，and f unctional analysis of the gene coding f or cal modulin in the Chytridiomycete Blastocladiell a emersonii［J］.Jour nal of Bacteriology，2001，183（7）：2280－2288.

［8］ Ras mussen C D，Means R L，Lu K P，May G S，Means A R.Characterization and expression of the unique cal modulin gene of Asper gill us nidul ans［J］.Journal of Biological Chemistry，1990，265（23）：13767－13775.

［9］ Saporito S M，Sypherd P S.The isolation and characterization of a cal modulin－encoding gene（CMD）from the dimorphic f ungus Candida albicans［J］.Gene，1991，106（1）：43－49.

［10］ Liu T，Williams J，Clar ke M.Inducible expression of cal modulin antisense RNA in Dictyosteliu m cells inhibits the co mpletion of cytokinesis［J］.Molecular Biology of t he Cell，1992，3（12）：1403－1413.

［11］ Pieterse C M，Verbakel H M，Spaans J H，Davidse L，Govers F.Increased expression of the cal modulin gene of the late blight f ungus Phytophthor a inf estans during pathogenesis on potato［J］.Molecular Plant－Microbe Interactions，1993，6（2）：164－172.

［12］ Melnick M B，Melnick C，Lee M，Wood ward D O.Str ucture and sequence of the cal modulin gene fro m Neurospor a cr assa［J］.Biochi mica et Biophysica Acta（BBA）－Gene Structure and Expression，1993，1171（3）：334－336.

［13］ Yasui K，Kitamoto K，Go mi K，Ku magai C，Ohya Y，Tamura G.Cloning and nucleotide sequence of t he cal modulin－encoding gene（c md A）fro m Asper gill us or yzae［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1995，59（8）：1444－1449.

［14］ El－Rady J，Shearer G.Isolation and characterization of a cal modulin－encoding c DNA from the pathogenic f ungus Histopl asma capsul atum［J］.Medical Mycology，1996，34（3）：163－169.

［15］ War war V，Dick man M B.Effects of calcium and cal modulin on spore ger mination and appressorium develop ment in Colletotrichu m trif olii［J］.Applied and Environ mental Microbiology，1996，62（1）：74－79.

［16］ Ki m Y K，Li D，Kolattukudy P E.Induction of Ca2＋－cal modulin signaling by hard－surface contact primes Colletotrichum gloeosporioides conidia to ger minate and f or m appressoria［J］.Jour nal of Bacteriology，1998，180（19）：5144－5150.

［17］ Kraus P R，Nichols C B，Heit man J.Calciu m－and calcineurin－independent roles for cal modulin in Cr yptococcus neof ormans morphogenesis and high－temperature growth［J］.Eukaryotic Cell，2005，4（6）：1079－1087.

［18］ Pryor B M，Bigelo w D M.Molecular characterization of Embellisia and Ni mbya species and their relationship to Alter naria，Ulocl adium and Stemphylium［J］.Mycologia，2003，95（6）：1141－1154.

［19］ Liu Y G，Chen Y L.High－efficiency ther mal asy mmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］.Biotechnology Techniques，2007，43：649－656.

［20］ 劉自勇，孫憲昀，曲音波.斜臥青霉114－2 cbh1基因的TAIL－PCR克隆及與抗阻遏突變株JU－A10的比較［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48（5）：667－671.

［21］ 楊帆，林俊芳，苗靈鳳，郭麗瓊.利用TAIL－PCR 和RT－PCR 技術(shù)克隆云芝植酸酶基因［J］.應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)報(bào)，2006，12（5）：618－622

［22］ 趙俊霞，陳穎，王立安.鈣信號(hào)途徑參與小斑病菌致病過(guò)程的調(diào)控［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32（4）：1－4.

［23］ 王立安，王源超，李昌文，鄭小波.Ca2＋信號(hào)途徑參與稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的調(diào)控［J］.菌物系統(tǒng)，2003，22（3）：457－465.

［24］ Uh m K H，Ahn I P，Ki m S，Lee Y H.Calciu m／cal modulin－dependent signaling for prepenetration develop ment in Colletotrichu m gloeosporioides［J］.Phytopathology，2003，93（1）：82－87.

［25］ Lee M H，Bostock R M.Induction，regulation，and role in pathogenesis of appressoria in Monilinia f r ucticola［J］.Phytopat hology，2006，96（10）：1072－1080.

［26］ Ahn I P，Suh S C.Calcium restores prepenetration morphogenesis abolished by methylglyoxal－bis－guanyl hydrazone in Cochliobol us miyabeanus infecting rice［J］.Phytopathology，2007，97（3）：331－337.

［27］ Ahn I P，Ki m S，Choi W B，Lee Y H.Calciu m restores prepenetration morphogenesis abolished by polyamines in Colletotrichu m gloeosporioides infecting red pepper［J］.FEMS Microbiology Letters，2003，227（2）：237－241.

［28］ Sabie F，Gadd G.Involvement of a Ca2＋－cal modulin interaction in the yeast－mycelial（YM）transition of Candida albicans［J］.Mycopathologia，1989，108（1）：47－54.

［29］ Chung K R.Involvement of calciu m／cal modulin signaling in cercosporin toxin biosynt hesis by Cercospor a nicotianae［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（2）：1187－1196.

［30］ War war V，Oved S，Dick man M B.Antisense expression of t he cal modulin gene fr o m Colletotrichu m trif olii i mpairs prepenetration develop ment1［J］.FEMS Microbiology Letters，2000，191（2）：213－219.

［31］ Liu Z M，Kolattukudy P E.Early expression of the cal modulin gene，which precedes appressoriu m for mation in Magnaporthe grisea，is inhibited by self－inhibitors and requires surface attach ment［J］.Journal of Bacteriology，1999，181（11）：3571－3577.