張淑卿，李劍峰，陳力玉，師尚禮，苗陽陽

（1.貴州師范學(xué)院 地理與旅游學(xué)院，貴州 貴陽550018；2.貴州師范學(xué)院 喀斯特生境土壤與環(huán)境生物修復(fù)研究所，貴州 貴陽550018；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；4.中國草學(xué)會，北京100193）

細(xì)菌間DNA 的轉(zhuǎn)移方式主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合及原生質(zhì)體的細(xì)胞融合。三親本雜交是基于雙親本雜交的接合轉(zhuǎn)移，應(yīng)用較為廣泛。青色熒光蛋白cf p 是綠色熒光蛋白gf p 的突變體，編碼基因表達(dá)后不損傷宿主細(xì)胞也無需底物，適用于活體檢測［1］，且耗能低，能產(chǎn)生更明亮的藍(lán)－綠色或青色熒光［2］，用于檢測根瘤菌的占瘤率和示蹤根瘤菌侵染結(jié)瘤，過程直觀、精確而易于操作［3］。凌瑤［4］指出攜帶cf p 基因的質(zhì)粒適用于構(gòu)建豌豆（Phaseol us r hizobia）根瘤菌熒光標(biāo)記株，且能穩(wěn)定表達(dá)。在接合子的分離和甄選過程中［5］，目前多以含抗生素選擇平板來分離cf p 供體菌和熒光標(biāo)記根瘤菌株。而對“假接合子”，則以檢測結(jié)瘤能力，以及根瘤是否發(fā)熒光予以排除［6］，大量標(biāo)記菌株的甄選驗(yàn)證存在一定的困難。

為探討以三親本雜交法構(gòu)建苜蓿根瘤菌cf p 熒光標(biāo)記株的可行性和適用性，簡化后期篩選驗(yàn)證流程，提高標(biāo)記菌株選育效率并獲得優(yōu)良的熒光標(biāo)記菌株。本研究擬在三親本雜交法構(gòu)建cf p 熒光標(biāo)記苜蓿根瘤菌的基礎(chǔ)上，通過抗生素選擇平板和無氮培養(yǎng)基對標(biāo)記株進(jìn)行篩選和甄別，對優(yōu)良菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證和宿主回接鑒定，并通過測定回接植株的生物量、結(jié)瘤特性和發(fā)光根瘤的數(shù)量探討優(yōu)良標(biāo)記株的促生能力和熒光表達(dá)能力，為苜蓿根瘤菌熒光標(biāo)記株的構(gòu)建，甄選和驗(yàn)證方法的優(yōu)化和改進(jìn)提供參考和依據(jù)，并為苜蓿根瘤菌競爭結(jié)瘤及菌體在宿主體內(nèi)的遷移研究提供優(yōu)良的標(biāo)記菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供體菌株為含cf p 熒光基因質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli p MP4517；輔助菌株為大腸桿菌Escherichia coli p RK2073。均由教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

受體菌株為苜蓿根瘤菌Rhizobiu m melil oti GN5，分離自甘農(nóng)5 號紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.5）種子，由教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)中科院微生物鑒定與保藏中心鑒定［6］；苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinor hizobiu m meliloti 12531，購自中科院微生物保藏中心［7］。

1.1.2 培養(yǎng)基 Y MA 培養(yǎng)基參照殷愛華和韓素芬［8］的方法配制，用于根瘤菌的增殖培養(yǎng)。

TY（Yeast Tryptone Agar）培養(yǎng)基參照袁全等［9］的方法配制，用于標(biāo)記菌株熒光表達(dá)能力的觀察檢測。

LB（Luria Bertani）培養(yǎng)基參照胡元森等［10］的方法配制，用于供體菌及輔助菌的增殖培養(yǎng)。

SM（Supplemental Mediu m）培養(yǎng)基參照陳力玉［11］的方法配制，用于菌體的分離培養(yǎng)。

Winogradsky無氮液體培養(yǎng)基參照Islam 等［12］的方法配制，用于接合子固氮能力的快速檢測。

上述培養(yǎng)基均以121 ℃濕熱滅菌26 min。

含抗生素固體培養(yǎng)基的配制：抗生素溶液壯觀霉素（Spe）和慶大霉素（Gm）各0.005 g，各加入100 mL去離子水溶解后經(jīng)0.22μm 的無菌濾膜過濾，制成濃度為50μg·mL－1的溶液。待配制的固體培養(yǎng)基冷卻至40 ℃左右時加入，制成TY／LB／SM 含藥固體平板。

1.1.3 植物材料 甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子由教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，種子發(fā)芽率90.6%，凈度98.5%。

1.2 熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建及篩選

1.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照楊坤等［13］的方法，將4 ℃下保存的受體菌R.melil oti GN5和S.meliloti 12531轉(zhuǎn)接于Y MA 固體培養(yǎng)基，28 ℃活化24 h后轉(zhuǎn)接于50 mL Y MA 液體培養(yǎng)基。28℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)3～4 h，至菌液OD600為0.4時置于鹽水冰上預(yù)冷，15 min后將預(yù)冷菌液轉(zhuǎn)入已在－1.5 ℃預(yù) 冷 的50 mL 離 心 管 中，4 ℃、3 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液并加入15 mL 預(yù)冷（－1.5 ℃）的0.1 mol·L－1的無菌CaCl2溶液，使菌體重新懸浮后于鹽水冰塊上處理20～30 min后4 ℃、3 000 r·min－1離心5 min。棄上清液，在菌體沉淀中加入－1.5℃預(yù)冷的0.1 mol·L－1無菌Ca Cl2溶液，振蕩至菌體充分懸浮后加入適量預(yù)冷Ca Cl2溶液至菌液OD600為0.5。

1.2.2 三親本雜交法熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建及篩選 混合菌體準(zhǔn)備：在凌瑤［4］的方法基礎(chǔ)上予以改進(jìn)，即在含慶大霉素（Gm）50μg·mL－1和壯觀霉素（Spe）50μg·mL－1的LB 固體培養(yǎng)基活化供體菌E.coli 4517 和輔助菌E.coli 2073。28 ℃培養(yǎng)16～18 h，分別轉(zhuǎn)接菌株到含50μg·mL－1Gm 和50μg·mL－1Spe的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期（OD600＝0.5）。將以上供體菌、輔助菌、受體菌（R.meliloti GN5和S.meliloti 12531的感受態(tài)細(xì)胞）的菌液各1.5 mL混合，8 000 r·min－1離心5 min得到混合菌體沉淀，棄上清后向沉淀加入1 mL無抗生素TY液體培養(yǎng)基，振蕩打勻并8 000 r·min－1離心5 min，棄去上清后留混合菌體沉淀。

混合培養(yǎng)：取0.22μm 無菌濾膜貼于TY 固體平板表面，每皿貼3片；取菌體沉淀加1 mL 無菌水打散成濃菌液，在濾膜中央加0.2 mL濃菌液，28℃正置2 h后倒置培養(yǎng)。2～3 d后取已長出培養(yǎng)物的濾膜置入無菌西林瓶，加5 mL 無菌水洗下菌體，再用無菌水稀釋10倍后取0.2 mL 菌液在SM＋Gm固體平板上進(jìn)行涂抹，28 ℃培養(yǎng)7 d后在平板上挑取50個單菌落，編號后分別點(diǎn)接于無抗生素TY 培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)（每菌株3次重復(fù)）。在WFH－204紫外分析儀336 n m 下檢測菌落，選擇可發(fā)青色熒光單菌落的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于Winogradsky無氮培養(yǎng)基，無氮平板上能正常生長的菌株則為熒光標(biāo)記根瘤菌（接合子）。

1.3 標(biāo)記根瘤菌的遺傳穩(wěn)定性檢測

將篩選得到的R.meliloti GN5和S.meliloti 12531接合子重新編號后接種于不加抗生素的TY固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3 d后記為第1代。再轉(zhuǎn)接至TY 固體斜面培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)，每隔36 h傳代一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接7次計8代，檢測每代菌株形成單菌落的熒光表達(dá)狀況并計算熒光質(zhì)粒的丟失率。

1.4 標(biāo)記根瘤菌的回接鑒定

參照李劍峰等［14］的方法以甘農(nóng)5號紫花苜蓿對篩選出的熒光標(biāo)記菌進(jìn)行回接鑒定?；亟釉囼?yàn)參照張志芳和夏叔芳［15］的方法，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計［16］進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每菌株4次重復(fù)，以不接菌的處理為對照。以單個無菌沙培盆栽作為一次重復(fù)、每盆栽內(nèi)播種表面滅菌的苜蓿種子4粒，出苗3 d后留苗1株。盆栽標(biāo)號后加托盤在光照培養(yǎng)室內(nèi)隨機(jī)排列擺放，參照李劍峰等［14］的方法進(jìn)行日常管理。處理45 d后測定植株的生物量、株高、根長、單株結(jié)瘤數(shù)和根瘤重。

根瘤固氮酶活性測定：參照Hara等［17］的方法進(jìn)行。測定參數(shù)：柱溫175 ℃，進(jìn)樣溫度150 ℃，F(xiàn)ID 170℃，進(jìn)樣50μL，每處理3次重復(fù)。

標(biāo)記菌占瘤率的測定：以蒸餾水無損清洗回接苗根系，無菌水沖洗3～5次，每單株收集全部根瘤，根瘤表面滅菌后參照張淑卿［18］的方法用WFH－204紫外分析儀在336 n m 下檢測，產(chǎn)生青色熒光的根瘤即為熒光標(biāo)記株侵染形成［11］。根據(jù)以上步驟，逐步篩選出熒光表達(dá)能力強(qiáng)、熒光質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定、占瘤率高、固氮酶活性高且能使苜蓿植株生物量增加的熒光標(biāo)記菌株。

1.5 數(shù)據(jù)分析

參照Muhammad等［19］以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較；采用Excel 2007制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記根瘤菌接合子的構(gòu)建和初選

兩種根瘤菌從SM＋Gm 平板上選出的各50個能在TY 培養(yǎng)基上形成菌落的接合子，336 n m 紫外光照射下均出現(xiàn)青色熒光（圖1）。但S.meliloti 12531菌株的接合子中，8個菌株的3次重復(fù)均能在無氮固體培養(yǎng)基上正常生長（表1），R.meliloti GN5的11個菌株的3次重復(fù)能在無氮固體培養(yǎng)基上正常生長（表2），表明菌株的固氮能力能夠穩(wěn)定遺傳；綜合接合子的生長和發(fā)光特性，篩選出S.meliloti 12531菌株的8 個接合子，R.meliloti GN 5菌株的1 1個接合子。可見在SM ＋Gm上獲得的大部分接合子在傳代過程中固氮性能并不穩(wěn)定，僅約16%～22%的菌體可穩(wěn)定遺傳。因此，若未經(jīng)無氮培養(yǎng)基復(fù)篩，則可能會有部分固氮性能缺失的菌體進(jìn)入后期的篩選流程，而3次重復(fù)以上的無氮培養(yǎng)基復(fù)篩對獲得穩(wěn)定的熒光標(biāo)記固氮菌株是必要的。

Fig.1 Luminescence conditions for fluorescence mar kedRhizobium str ains and the original Rhizobium stains under portable long wave ultr aviolet lamp（336 n m）

表1 S.meliloti 12531菌株接合子的篩選Table 1 Bacterial conjugant screening for S.meliloti 12531

2.2 熒光標(biāo)記根瘤菌的遺傳穩(wěn)定性

初選獲得的接合子在無抗生素的TY 固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代8次后，熒光質(zhì)粒的丟失率均低于10%（表3），可見cf p 熒光質(zhì)粒隨宿主菌的傳代能進(jìn)入下一代菌體，并在次代菌體細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制。表明固氮能力穩(wěn)定的菌株與熒光質(zhì)粒的結(jié)合能力較好，其 中 丟 失 率 為0 的S.meliloti 12531－cf p6、S.meliloti 12531－cf p8、R.meliloti GN5－cf p5 及R.meliloti GN5－cf p 9熒光表達(dá)能力也最強(qiáng)，最終作為熒光標(biāo)記株進(jìn)行宿主植株回接試驗(yàn)。說明穩(wěn)定的固氮能力對菌株維持自身細(xì)胞內(nèi)cf p 標(biāo)記質(zhì)粒的熒光表達(dá)和質(zhì)粒伴隨宿主繼代有積極的作用，這可能與充足的氮素供應(yīng)有利于蛋白、核酸和酶類合成、進(jìn)而促進(jìn)菌體細(xì)胞及cf p 基因標(biāo)記質(zhì)粒的正常分裂和增殖相關(guān)，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究確定。

表2 R.meliloti GN5菌株接合子的篩選Table 2 Bacterial conjugant screening for R.meliloti GN5

2.3 熒光標(biāo)記根瘤菌的回接鑒定和篩選

接種標(biāo)記菌的苜蓿幼苗的生物量和株高與未接種植株（CK）有明顯差異（表4）。其中回接S.melil oti 12531－cf p 6、S. melil oti 12531－cf p 8 及R.meliloti GN5－cf p5 菌 株 的 生 物 量 高 出 對 照90.5%～104.8%，與對照差異顯著（P＜0.05）。S.meliloti 12531－cf p6、S.meliloti 12531－cf p8和R.meliloti GN5－cf p 5回接植株的株高較對照高出56.36%～69.16%，與對照差異顯著。4 株標(biāo)記菌回接植株的根長與對照無顯著差異（P＞0.05），因此苜蓿根瘤菌熒光標(biāo)記株能有效促進(jìn)幼苗地上部分的生長，增加其生物量和干物質(zhì)積累?？梢妰?yōu)良的標(biāo)記菌盡管具備熒光表達(dá)特性，額外的標(biāo)記質(zhì)粒需要消耗部分菌體及菌體宿主植物的碳水化合物，但并未顯著影響菌體對植株的促生作用。故優(yōu)良的標(biāo)記菌中，攜帶cf p 熒光標(biāo)記基因的質(zhì)粒其熒光表達(dá)效率較高而能耗較低。

侵染寄主植株形成有效根瘤是根瘤菌的主要特性。盡管未接種的對照處理也出現(xiàn)根瘤，但數(shù)量和鮮重等均較低，且無發(fā)光根瘤（表5）。4 株熒光標(biāo)記菌回接植株的根瘤數(shù)、單個根瘤鮮重及固氮酶活性均顯著高于對照，紫外光下根瘤的熒光表達(dá)強(qiáng)度較高（圖2）。其中，S.meliloti 12531－cf p6、S.meliloti 12531－cf p 8、R.meliloti GN5－cf p5及R.meliloti GN5－cf p9 的根瘤數(shù)高出對照125%～350%，單個根瘤鮮重高出對照300%～750%，固氮酶活性為對照的14.7～30.9 倍。除S.meliloti 12531－cf p 6 處 理 占 瘤 率 高 于S.meliloti 12531－cf p8處理18.6%外，其他根瘤指標(biāo)與S.meliloti 12531－cf p8 處 理 差 異 不 顯 著（P ＞0.05），R.meliloti GN5－cf p5 處理的所有根瘤指標(biāo)測定結(jié)果均顯著高于R.meliloti GN5－cf p9 處理（P＜0.05）。根據(jù)植物促生能力、結(jié)瘤情況和占瘤率，S.meliloti 12531－cf p 6 及R.meliloti GN5－cf p5可分別作為S.meliloti 12531 和R.meliloti GN5的標(biāo)記菌株用于進(jìn)一步的研究。上述結(jié)果可知，同一出發(fā)菌株的三親本雜交后代中，結(jié)瘤及固氮能力差異存在著顯著的差異。這說明三親本雜交時，質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體菌株的數(shù)量可能是隨機(jī)的，對菌體能量的消耗也不同。因此，為獲得優(yōu)良的標(biāo)記菌株，對接合子進(jìn)行宿主植物的回接驗(yàn)證是必要的。

表3 S.meliloti 12531及R.meliloti GN5菌株接合子熒光質(zhì)粒丟失率Table 3 Lose rate of fluorescent plasmid derived from the conjugants of S.meliloti 12531 and R.meliloti GN5

表4 標(biāo)記根瘤菌對苜蓿幼苗生長的影響Table 4 Effects of mar ked Rhizobia on growth of alfalfa seedlings

表5 標(biāo)記根瘤菌對苜蓿幼苗根瘤的影響Table 5 Effects of mar ked Rhizobia on nodules of alfalfa seedlings

圖2 熒光標(biāo)記菌侵染形成的發(fā)光根瘤Fig.2 Lu minescent root nodules induced by mar ked Rhizobia strains

3 討論與結(jié)論

cf p 熒光基因借助宿主范圍較廣的接合質(zhì)粒，通過受體菌與質(zhì)粒供體菌細(xì)胞間的緊密接觸由供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞［20］。三親本雜交是在雙親本雜交的基礎(chǔ)上，使質(zhì)粒在輔助菌的協(xié)助下進(jìn)入受體菌，如將cf p 熒光基因?qū)氲酵愣垢鼍竽軌蚍€(wěn)定表達(dá)［4］。本研究中，三親本雜交法可高效構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的cf p 熒光標(biāo)記苜蓿根瘤菌，構(gòu)建的標(biāo)記根瘤菌在TY 固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代8次后，cf p 熒光質(zhì)粒的丟失率均低于10%。

三親本雜交法中，難以區(qū)分選擇培養(yǎng)基上出現(xiàn)的根瘤菌耐藥突變株和供體菌、輔助菌的營養(yǎng)缺陷回復(fù)突變株，即“假接合子”。本研究中，假接合子或喪失固氮能力的標(biāo)記菌株比例較高，若以反復(fù)的形態(tài)觀察和宿主回接試驗(yàn)，以是否結(jié)瘤，以及根瘤是否產(chǎn)生熒光來區(qū)分，則復(fù)雜耗時［11］。因此，借助根瘤菌株在無氮培養(yǎng)基上正常生長的特性，用無氮和TY 固體培養(yǎng)基同步驗(yàn)證菌種的固氮和發(fā)光特性，簡化了篩選驗(yàn)證流程，提高了標(biāo)記菌選育效率，具有良好的應(yīng)用前景。

外源質(zhì)粒對菌株共生固氮能力的影響可能是促進(jìn)、也可能是抑制［21］。一些根瘤菌在導(dǎo)入外源質(zhì)粒后侵染結(jié)瘤和共生固氮能力會有顯著提升［22］，可使宿主植株的根瘤鮮重、生物量及植株含氮量增加［23］。李杰等［22］以l ux AB 和par CBA 基因重組質(zhì)粒p HN208標(biāo)記的根瘤菌株，其競爭結(jié)瘤能力沒有負(fù)面影響，遺傳性狀穩(wěn)定。一些l ux AB 基因標(biāo)記的根瘤菌占瘤率可達(dá)61.3%，顯著優(yōu)于土著根瘤菌［24］。本研究也發(fā)現(xiàn)，源于同一出發(fā)菌株的熒光標(biāo)記株，其結(jié)瘤能力和固氮酶活性存在較大差異。因此除熒光表達(dá)強(qiáng)度外，對標(biāo)記菌株的結(jié)瘤及促生能力進(jìn)行驗(yàn)證也是必要的。

通過初選、復(fù)選和回接驗(yàn)證，本研究最終獲得了理想的標(biāo)記根瘤菌，其培養(yǎng)物和形成根瘤的熒光表達(dá)能力強(qiáng)，與出發(fā)菌株易于區(qū)分（圖1、2）并有良好的促生能力，能使甘農(nóng)5號紫花苜蓿植株生物量高出對照90.5%～104.8%、株高高出對照56.36%～69.16%，根瘤數(shù)高出對照125%～350%，根瘤鮮重高出對照300%～750%，固氮酶活性達(dá)到對照的14.7～30.9倍。其中的S.melil oti 12531－cf p 6 和R.meliloti GN5－cf p5熒光表達(dá)強(qiáng)度，占瘤率、根瘤的固氮酶活性等均高出其他標(biāo)記菌株，可用于進(jìn)一步的根瘤菌示蹤研究。

致謝：該論文是第二屆全國草業(yè)生物技術(shù)大會評選出的優(yōu)秀論文，并得到中國草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會提供的版面費(fèi)支持。

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