孫一丹，張興旭，古麗君，李秀璋，王萍，李春杰

( 草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅蘭州730020)

禾草－內生真菌(Fungal endophyte or Endophytic fungi)是指生長在植株體內并完成大部分或全部生活史周期，而宿主植物不顯示其外部癥狀的一類真菌［1-2］，包括香柱菌(Epichlo?)屬及其無性型Neotyphodium 屬［2］。禾草－內生真菌共生體的雙重特性已經(jīng)成為近年來研究的熱點領域之一。內生真菌侵染禾草形成互惠互利的共生體，內生真菌自宿主禾草體內獲取營養(yǎng)物質和生存空間，同時還提高了禾草的抗蟲性［3］和抗旱性［4］，促進禾草生長，提高禾草競爭能力［5］;但是共生體中通常也會產生一些有毒的次生代謝產物，如生物堿類物質可引致家畜中毒，給草地畜牧業(yè)生產造成了巨大的損失［5-7］。有關禾草內生真菌共生體和家畜的研究，主要集中在內生真菌侵染的高羊茅(Festuca arundinacea)和多年生黑麥草(Lolium perenne)等禾草，如美國的“牛狐茅中毒癥”是由于內生真菌(E. coenophiala)侵染高羊茅產生麥角酸Ergovaline 所致［6］，新西蘭的“綿羊黑麥草蹣跚病”是由內生真菌(E. festucae var. lolii)侵染多年生黑麥草產生吲哚雙萜類Lolitrem B所致［7］。

近年來，蘭州大學草地農業(yè)科技學院對醉馬草－內生真菌共生體開展了系統(tǒng)研究，南志標和李春杰課題組對醉馬草(Achnatherum inebrians)中內生真菌帶菌率檢測和共生體的分布［8-9］;內生真菌侵染提高醉馬草的抗旱性［10］、耐鹽堿性［11］、抗寒性［12］、耐重金屬脅迫［13-14］和抗蟲性［15］;內生真菌和病原真菌互作［8，16］、共生體的生物堿［17-19］和動物飼喂試驗［20-21］等諸多方面進行了研究。有關醉馬草－內生真菌共生體中生物堿的研究，目前主要集中在共生體中麥角新堿和麥角酰胺的時空分布和季節(jié)動態(tài)［8，17］、影響共生體產堿的因素［19，22］及其對脅迫的響應［18］等。

有關黑麥草內生真菌的研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草內生真菌可以顯著抑制細交鏈孢(Alternaria alternata)、燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)、小孢殼二孢(Ascochyta leptospora)、燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)

和新月彎孢(Curvularia lunata)等多種植物病原真菌的菌落繁殖和孢子萌發(fā)，從而提高黑麥草離體葉片的抗病性［23-24］。有關醉馬草內生真菌的抗病性研究亦發(fā)現(xiàn)，E. gansuensis 可顯著抑制包括銳頂鐮孢(F. acuminatum)、細交鏈孢和新月彎孢在內的多種植物病原真菌的菌落擴張及孢子萌發(fā)［16］。楊松等［25］和張興旭［26］的研究結果也表明，醉馬草草粉浸提液和粗提物各部分浸膏對常見植物病原真菌具有很強的抑菌活性。本研究旨在通過比較帶內生真菌(E+)和不帶內生真菌(E －)的醉馬草生物堿提取液對8 種常見的植物病原真菌，麥角菌(Clavieps purpurea)、德氏霉(Drechslera erythrospila)、燕麥鐮孢、根腐離蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、新月彎孢、半裸鐮孢(F. semitectum)、腐皮鐮孢(F. solani)和細交鏈孢的抑菌活性，明確內生真菌侵染醉馬草產生生物堿的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 試驗所用的醉馬草種子于2013 年10 月采自蘭州大學榆中校區(qū)溫室(103°36'52″ E，36°28'42″ N)種植的帶內生真菌(E +)和不帶內生真菌(E－)的醉馬草植株。挑選籽粒飽滿、表面健康的醉馬草種子于2013 年11 月播種于裝有300 g混合培養(yǎng)基質(蛭石∶ 珍珠巖=3∶ 1)的聚乙烯花盆(口徑15 cm，底徑10 cm，深12 cm)中，在溫室條件下［光周期12 h 光照，溫度(20 ±1)℃，光照強度120 μmol·m－2·s－1］培養(yǎng)幼苗。

1.1.2 菌種 試驗所用的菌種(麥角菌、德氏霉、燕麥鐮孢、根腐離蠕孢、新月彎孢、半裸鐮孢、腐皮鐮孢、細交鏈孢)均由草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室草地保護所自多年生黑麥草、醉馬草和草地早熟禾(Poa pratensis)等禾草分離獲得并于(22 ±2)℃黑暗條件下在葡萄糖－瓊脂－馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)(生化培養(yǎng)箱LRH-250A，廣東)。各菌種純化后密閉保存在斜面試管培養(yǎng)基上，4 ℃低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 生物堿提取 分別將E +和E －醉馬草風干，研磨后將粉樣裝袋備用。按照Zhang 等［19］的方法，繼續(xù)醉馬草生物堿的提取。分別取草粉樣品6.25 g 放入兩個1 000 mL 的三角瓶中，并加入125 mL 的75 ∶ 25 ∶ 2 的CHCl3(氯 仿)∶ MeOH(甲醇)∶ NH4OH(氨水)液體于三角瓶中，用錫箔紙包裝并打開蓋子在通風處放置12 ～15 h，待其揮發(fā)至無液體存在后再加入375 mL 的1∶ 2 的MeOH(甲醇)∶ CCl4(四 氯 化 碳)溶 液 和125 mL 0. 375 g·100 mL－1的酒石酸溶液，輕微震蕩，待其完全溶解后，用錫箔紙對瓶子進行遮光處理靜置25 h 左右，待溶液分層，用一次性注射器吸取水相部分液體放入棕色瓶子中，即得到醉馬草生物堿提取液的原液，置于4 ℃冰箱中保存以備用。分別用C1、C2、C3代替原液的100%、50%及25%濃度。

1.2.2 醉馬草內生真菌提取液原液濃度的測定

參考Zhang 等［18-19］的方法，稱取50 mg 已經(jīng)冷凍干燥的醉馬草草粉，用Agilent 1100 series 高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent，USA)進行檢測。以ZORBAX-XDB C18 反相色譜柱(Agilent，USA)，流動相流速1 mL· min－1，進樣量20 μL，以VWD 紫外檢測器(Agilent，USA)進行檢測。流動相分別為:A，0.1 mol·L－1NH4OAc;B，乙腈∶ 0.1 mol·L－1NH4OAc =3∶1。按照95%A 液5 min、80%A 液20 min、50%A 液5 min、90%A 液10 min 流動相配比與時間，檢測波長為312 nm。通過安捷倫色譜工作軟件(ChemStation for LC Rev. A. 10.01，USA)檢測進程并測定峰值面積，根據(jù)標樣確定的相關方程(標樣分別稀釋至5、10、15 和20 mg·kg－1濃度，用外標法來建立標準方程)和樣品稀釋的倍數(shù)，計算兩種生物堿的濃度。麥角新堿標樣分離自內生真菌侵染的甘肅夏河醉馬草(純度為99.99%)，麥角酰胺標樣由新西蘭AgResearch 公司W(wǎng)ade Mace 博士提供。

1.2.3 抑菌活性測定 將各供試菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，恒溫25 ℃培養(yǎng)7 d 后，用直徑6 mm 打孔器把活化的菌種打成菌碟，分別接種到含有不同濃度醉馬草提取液的培養(yǎng)基上，在(22 ±2)℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每個處理重復3 次。并以同樣的真菌菌碟接種到不含有提取液PDA 培養(yǎng)基上作為對照，在相同條件下培養(yǎng)。

生長速率測定:從接種之日起，于3 d 后開始測量并記錄結果，每隔3 d 測定一次，持續(xù)測定2 周。測量菌落直徑時，用游標卡尺讀數(shù)，采用十字交叉法讀取數(shù)據(jù)。對真菌菌落生長的抑制作用采用生長速率測定法［27］。

菌落生長抑制率=(DCK－DT)/DCK×100%。式中，DCK為對照菌落直徑，DT為處理菌落直徑。

孢子萌發(fā)率測定:對真菌孢子的萌發(fā)抑制作用采用孢子萌發(fā)法［28］，在無菌雙凹載玻片凹面內，滴加1 mL 各極性段已經(jīng)溶解好的活性成分，并滴加1 mL 植物病原真菌的孢子懸浮液將其混勻，孢子濃度以單個視野里面90 ～100 個為宜(10 ×40 倍鏡)，對照為未加活性成分的孢子懸浮液再加1 mL 無菌水，然后將其置于培養(yǎng)皿內(直徑為11 cm)恒溫25 ℃條件下保濕培養(yǎng)。每隔2 h 檢測一次孢子萌發(fā)情況。取3 次重復的平均值，每個重復觀測100 個孢子來檢查孢子萌發(fā)情況。

孢子萌發(fā)抑制率=(SCK－ST)/SCK×100%。式中，SCK為對照菌落直徑，ST為處理菌落直徑。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 錄入，用Word 進行表 格 制 作。采 用SPSS 13. 0(Ver. 13. 0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)統(tǒng)計分析軟件分別對各濃度處理條件下8 種植物病原真菌菌落生長的指標(菌落直徑和孢子萌發(fā))進行單因素方差分析(ANOVA)，選用Duncan 法進行多重比較，并就醉馬草提取液中生物堿濃度與孢子萌發(fā)抑制率進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 E+和E－醉馬草麥角類生物堿的含量

本研究所用E +醉馬草提取液的生物堿濃度，原液中麥角酰胺含量為369.1 mg·kg－1，麥角新堿含量為26.2 mg·kg－1;原液稀釋50%提取液中的麥角酰胺含量為189.2 mg·kg－1，麥角新堿含量為22.5 mg·kg－1;原液稀釋25%提取液中的麥角酰胺含量為86.1 mg·kg－1，麥角新堿含量為7. 9 mg·kg－1。E－醉馬草提取液中不含有這兩種麥角類生物堿。

2.2 E+和E－醉馬草提取液對8 種植物病原真菌菌落生長的影響

E+和E－醉馬草草粉浸提液對8 種供試真菌菌落生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用，E +的抑制率整體高于E －(表1)。其中，E +C1濃度對腐皮鐮孢的抑制率最高，達到了63%，E +C3濃度對新月彎孢的抑制率最低，為10%。E －C1濃度對腐皮鐮孢的抑制作用最高，為51%，E －C3濃度對新月彎孢的抑制率最低，僅有6%。

E+和E－醉馬草草粉浸提液對供試真菌菌落生長的抑制率隨著其濃度的減少呈逐漸下降的趨勢，新月彎孢在E+C1～C3各濃度之間差異均顯著(P ＜0.05);燕麥鐮孢和半裸鐮孢在E+C1和C3濃度之間差異顯著。離孺孢在E－C3濃度下與C1、C2之間差異均顯著;半裸鐮孢和腐皮鐮孢在E －C2和E－C3之間差異顯著。

在E+C1濃度條件下，腐皮鐮孢和麥角菌之間差異不顯著(P ＞0.05)，與其他各菌株之間差異均顯著(P ＜0.05)。在E +C2濃度條件下，腐皮鐮孢和麥角菌之間差異不顯著，與其他各菌株之間差異均顯著;半裸鐮孢、新月彎孢、麥角菌、德氏霉和離孺孢之間差異顯著。在E +C3濃度條件下，腐皮鐮孢與其他各菌株之間差異均顯著;細交鏈孢與燕麥鐮孢和德氏霉之間無顯著差異，與其他各菌株之間差異均顯著。腐皮鐮孢、麥角菌和新月彎孢在E－C1濃度條件下差異顯著，且與其他各菌株之間差異均顯著。腐皮鐮孢、麥角菌、細交鏈孢和新月彎孢在E－C2濃度條件下差異顯著，且與其他各菌株之間差異均顯著。腐皮鐮孢、麥角菌和燕麥鐮孢在E －C3濃度條件無顯著差異，但與其他各菌株之間差異均顯著;細交鏈孢和離孺孢之間無顯著差異，但與其他各菌株之間差異均顯著。

2.3 E+和E－醉馬草提取液對8 種植物病原真菌孢子萌發(fā)的影響

E +和E －醉馬草草粉浸提液對8種供試真菌孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，E +的抑制率整體高于E －(表2)。其中，E +C1濃度對腐皮鐮孢的抑制率最高，達到了57%，E +C3濃度對離孺孢的抑制率最低，為14%。E －C1濃度對腐皮鐮孢的抑制作用最高，為46%，E －C3濃度對離孺孢的抑制率最低，僅有8%。

表1 醉馬草內生真菌生物堿提取液對不同菌落大小的抑制率影響Table 1 Effects of ergot alkaloids extraction from E+ and E－ Achnatherum inebrians on the mycelia growth of 8 grass pathogens %

表2 醉馬草內生真菌生物堿提取液對不同菌落孢子萌發(fā)的抑制率影響Table 2 Effects of ergot alkaloids extraction from E+ and E－ Achnatherum inebrians on the spores germination of 8 grass pathogens %

E+和E ―醉馬草草粉浸提液對供試真菌孢子萌發(fā)的抑制率隨著其濃度的減少呈逐漸下降的趨勢。離孺孢、燕麥鐮孢和德氏霉在E+C1、C2、C3濃度下均差異顯著(P ＜0.05);新月彎孢和細交鏈孢在E+C1和C3有顯著差異;半裸鐮孢和腐皮鐮孢在E +C1濃度與C2和C3之間有顯著差異。離孺孢、德氏霉和細交鏈孢在E―C1濃度與C2和C3之間有顯著差異，但是在C2和C3之間無顯著差異(P ＞0.05)。其他各菌株在E－C1～C3濃度之間均差異顯著。

腐皮鐮孢和新月彎孢在E +C1濃度條件下無顯著差異(P ＞0.05)，但與其他各菌株之間差異均顯著(P ＜0.05);燕麥鐮孢、麥角菌和半裸鐮孢在E+C1濃度條件下無顯著差異，但與其他各菌株之間差異均顯著。新月彎孢、麥角菌和離孺孢在E +C2濃度條件下差異顯著，且與除燕麥鐮孢外的其他各菌株之間差異均顯著。新月彎孢、麥角菌和燕麥鐮孢在E+C3濃度條件下差異顯著;離孺孢和德氏霉之間無顯著差異，但與其他各菌株之間差異均顯著。腐皮鐮孢和新月彎孢在E －C1濃度條件下無顯著差異，但與除燕麥鐮孢外的其他各菌株之間差異均顯著。燕麥鐮孢和新月彎孢在E －C2濃度條件下之間無差異顯著，但與離孺孢、麥角菌差異顯著;離孺孢與其他各菌株之間差異均顯著。新月彎孢在E－C3濃度條件下與其他各菌株之間差異均顯著;燕麥鐮孢與離孺孢、新月彎孢之間差異顯著，與其他菌株間無顯著差異。

2.4 生物堿濃度和植物病原真菌回歸分析

E+醉馬草生物堿提取液濃度與8 種植物病原真菌孢子萌發(fā)抑制率呈顯著正相關關系(P ＜0.05)。就E+生物堿和植物病原真菌孢子萌發(fā)進行回歸分析，得到E+醉馬草提取液中生物堿濃度與8 種植物病原真菌孢子萌發(fā)抑制率的回歸方程(表3)。

3 討論與結論

本研究首次以帶內生真菌(E +)和不帶內生真菌(E－)的醉馬草生物堿提取液為材料，研究其對8種常見的植物病原真菌(麥角菌、德氏霉、燕麥鐮孢、根腐離蠕孢、新月彎孢、半裸鐮孢、腐皮鐮孢和細交鏈孢)的抑菌活性，結果表明，E +和E －醉馬草提取液對上述8 種植物病原真菌的菌落生長和孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用，E +醉馬草提取液中檢測到了麥角類生物堿，且麥角堿與植物病原真菌的孢子萌發(fā)具有顯著的相關性(P ＜0.05)。首次明確了內生真菌侵染醉馬草增強了其草粉浸提液對病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的抑制作用。

表3 醉馬草生物堿提取液與病原真菌孢子萌發(fā)抑制率的回歸分析Table 3 Regression equation of the concentractions of E+ alkaloids extraction and the spores germination of 8 grass pathogens

Li 等［16］的研究結果表明，N. gansuense 可以顯著抑制細交鏈孢、根腐離蠕孢、新月彎孢和銳頂鐮孢的菌落擴張。本研究結果表明，E+和E－醉馬草粗提物對8 種真菌的菌落生長均具有顯著的抑制作用，這與馬敏芝和南志標［23］報道的黑麥草內生真菌可以抑制細交鏈孢、新月彎孢菌和燕麥鐮刀菌等多種植物病原真菌的菌落生長，從而提高黑麥草離體葉片抗病性的結果相似;謝鳳行和任安芝［29］在羽茅(A. sibiriu)和高羊茅內生真菌抗病性的研究中也發(fā)現(xiàn)，內生真菌能夠抑制鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、立枯絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)、彎孢霉屬(Curvularia spp.)、枝孢霉屬(Cladosporium spp.)和擬莖點霉屬(Phomopsis spp.)等植物病原真菌的菌落生長，本研究結果與之相似。

Li 等［16］研究表明，E. gansuensis 可以顯著抑制細交鏈孢、根腐離蠕孢、新月彎孢的孢子萌發(fā);馬敏芝和南志標［23］的研究也發(fā)現(xiàn)，黑麥草內生真菌可以顯著抑制細交鏈孢、新月彎孢菌和燕麥鐮刀菌等多種植物病原真菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長。楊松等［25］的研究結果發(fā)現(xiàn)，內生真菌的侵染可增強醉馬草、披堿草(Elymus dahuricus)和野大麥(Hordeum brevisubulatum)草粉浸提液對細交鏈孢、根腐離蠕孢、燕麥鐮孢和綠色木霉(Trichoderma viride)4 種真菌孢子萌發(fā)的抑制作用。謝鳳行和任安芝［29］的研究發(fā)現(xiàn)，分離自羽茅和高羊茅中的內生真菌經(jīng)過液體培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液亦可抑制病原真菌的孢子萌發(fā);本研究結果也表明，E +和E －醉馬草粗提物對8 種供試植物病原真菌的孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用，與上述研究結果相類似。

馬敏芝和南志標［23］的研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草內生真菌可以顯著抑制細交鏈孢、新月彎孢和燕麥鐮刀菌等多種植物病原真菌的芽管伸長，從而提高黑麥草活體植株的抗病性。Tian 等［24］的研究結果也表明，黑麥草內生真菌可以顯著抑制根腐離蠕孢的孢子萌發(fā)和芽管伸長，從而提高黑麥草離體葉片的抗病性。楊松等［25］的研究結果也發(fā)現(xiàn)，內生真菌的侵染可以增加醉馬草、披堿草和野大麥草粉提取液對包括細交鏈孢在內的4 種真菌芽管伸長的抑制作用。張興旭［26］的研究也發(fā)現(xiàn)，E +醉馬草提取液對6 種真菌的芽管伸長具有顯著的抑制作用。

通過高效液相色譜(HPLC)檢測發(fā)現(xiàn)，E +醉馬草中含有大量的麥角類生物堿(麥角新堿和麥角酰胺)和其他化合物成分，而E－醉馬草中未檢測到這些生物堿，由此可以推斷內生真菌產生的生物堿可能跟醉馬草的抗病性有關。

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