湯 強(qiáng)，劉玉軍，方 玲

（1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2.安徽科學(xué)技術(shù)研究院，安徽 合肥 230036）

昆蟲病原真菌蛋白酶在侵染昆蟲的過程中起重要作用，真菌侵染能力很大程度取決于蛋白酶酶活性高低[1]。玫煙色棒束孢是一類廣泛分布于世界各地的昆蟲病原真菌，寄主達(dá)25個不同科的昆蟲，包括小菜蛾、麥雙尾蚜和煙粉虱等一些重要農(nóng)業(yè)害蟲，是生物防治中極具開發(fā)應(yīng)用潛力的種類。本研究根據(jù)Ifupr1基因組序列5′-末端核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用基因組步移的方法，成功獲得其上游啟動子區(qū)，為深入研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用菌株保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，雙翅目蛹為其寄主。

1.2 高純度基因組DNA制備

采用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0對實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)物進(jìn)行基因組DNA的提取，并電泳法鑒定后完成濃度測定，-20℃保存。

1.3 基因組DNA的擴(kuò)增

參考前期研究中5′和3′端片段序列來合成引物，同時(shí)以基因組 DNA和反轉(zhuǎn)錄第一條鏈做為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

取5 μl PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，并克隆測序。

1.4 基因組步移擴(kuò)增Ifupr1基因5′-上游區(qū)序列

以Ifupr1基因組DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)三條下游引物P-SP1，P-SP2，P-SP3。

采用GENOME Walking kit（TaKaRa）方法，基因組DNA為模板，完成3次熱不對稱PCR操作。

圖 1 基因組步移擴(kuò)增引物位置示意圖

1.5 PCR產(chǎn)物克隆測序

PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物采用試劑法純化回收并克隆pMD18-T載體，后送至專業(yè)公司完成測序工作。

1.6 序列分析

采用DNAMAN和PROSITE軟件[7]進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析；上游非編碼區(qū)域內(nèi)各轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)通過TFSEARC軟件預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0實(shí)驗(yàn)獲得純度較高、完整的基因組DNA，核酸測定儀測定濃度為2265ng/μl。符合進(jìn)行DNA步移的模板標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 cDNA全長序列的驗(yàn)證與結(jié)構(gòu)基因的獲得

利用合成引物，分別進(jìn)行基因組 DNA序列與cDNA序列PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測出兩條大小基本相同條帶，之后經(jīng)克隆測序結(jié)果鑒定兩序列完全相同，可判斷該基因中無內(nèi)含子。

2.3 Ifupr1基因上游序列的克隆與分析

DNA步移法測定上游序列長度為 1889bp，命名為Ifupr1b，與Ifupr1基因序列進(jìn)行比對分析有 581bp的序列完全重疊。故可以判定Ifupr1b上游序列。對Ifupr1b進(jìn)行序列分析（圖2所示）含有啟動子核心結(jié)構(gòu)序列CAAT框、特異的反應(yīng)元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) CdxA、GATA-1、GATA-2、壓力反應(yīng)元件 STREs (CCCCT)等。STREs存在于酵母一些與抗逆有關(guān)的基因的調(diào)控序列中，在加熱、高滲透壓、低 pH以及營養(yǎng)饑餓等壓力脅迫條件下，介導(dǎo)酵母相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。本研究表明，玫煙色棒束孢Ifupr1的轉(zhuǎn)錄也受到昆蟲體壁的誘導(dǎo)。

圖2 玫煙色棒束孢Ifupr1基因上游啟動子序列

真菌中氮阻遏通過氮阻遏子來完成，多個氮阻遏蛋白完成克隆，如粗糙脈孢菌 Neurospora crassa 中NIT2、構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans 中AREA和金龜子綠僵菌中nrr1。它們的共同特征是都含有C-X2-C-X17-C-X2-C型的鋅指結(jié)構(gòu)，在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)是相隔很近的序列-“GATA”，因此又被稱為GATA蛋白。在Ifupr1b中也發(fā)現(xiàn)了相隔很近的GATA序列，由此可以推測氮阻遏也可能是由與AREA，NIT2和nrr1類似功能的蛋白質(zhì)阻遏子完成。

3 討論

對Ifupr1基因上游啟動子序列分析表明，該序列不僅包含啟動子的核心結(jié)構(gòu)序列CAAT框，亦包含一些特異的反應(yīng)元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：GATA-1、GATA-2 、CdxA、CPEBP和Oct-1，因此，Ifupr1基因可能具有特異性調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能[2]。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，昆蟲病原真菌侵染昆蟲的分子機(jī)制得到了更深入的認(rèn)識，相關(guān)功能基因不斷得到克隆和研究，為真菌蛋白酶在生物防治中的應(yīng)用開辟了廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Samuels RI, Paterson IC.Cuticle degrading proteases from insect moulting fluid and culture filtrates of entomopathogenic fungi.Comparative Biochemistry and Physiology, 1995, 110：661～669

[2]胡宗利，陳國平，王中康等.綠僵菌 NTL基因上游調(diào)控序列的克隆及分析.重慶大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29：73～76.