摘要:目的探討P63/平滑肌肌動蛋白(SMA)雙標記法免疫組化檢查對乳腺癌診斷的效能。方法體檢發(fā)現(xiàn)乳腺腫塊的患者150例，行乳腺針吸檢查取病變組織，分別進行HE染色和P63/SMA雙標記法免疫組化染色，光鏡下觀察結(jié)果并分析。結(jié)果乳腺肌上皮細胞同時表達P63和SMA，非肌上皮細胞均不表達P63。HE染色、P63/ SMA雙標記法免疫組化染色檢查分別有32例、20例初診報告為乳腺良性病變，分別有119例、121例初診報告為可疑癌細胞或發(fā)現(xiàn)癌細胞。對比患者手術病理結(jié)果，HE染色對乳腺良性病變的診斷準確率為91%，P63/SMA雙標記法免疫組化檢查為97%; HE染色和P63/SMA雙標記法免疫組化檢查對乳腺惡性病變的診斷準確率均為100%。結(jié)論P63/SMA雙標記法免疫組化檢查對乳腺癌的確診率較高，且較HE染色可更好地鑒別乳腺良性病變。

doi: 10．3969/j．issn．1002-266X．2015．015．005

基金項目:河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目(20090159)。

第一作者簡介:王永軍(1967-)，主任技師，主要研究方向為臨床病理技術。E-mail: wyj5939@126．com

通信作者簡介:劉月平(1975-)，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為臨床病理診斷。E-mail: annama@163．com

Diagnostic efficiency of P63/SMA double labeled immunochemistry in lesion tissues of breast cancer

WANG Yong-jun 1，LYN Fei，WANG Xiao-xiao，WANG Ling，DING Chun-yan，F(xiàn)AN Xiao-jie，YANG Hui-chai，LIU Yue-ping

(1 The Fouth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China)

Abstract: Objective To investigate the diagnostic efficiency of P63/smooth muscle actin (SMA) double labeled immunochemistry in lesion tissues of breast cancer．Methods A total of 150 cases of patients with breast disease were selected as the subjects．Needle aspiration was performed to attain the breast specimens．HE staining and double labeled immunohistochemical staining of P63 and SMA were used．The results were observed and analyzed by using light microscope．Results Both P63 and SMA were positive in the vast majority of breast myoepithelial cells and P63 was negative in nonmyoepithelial cells．Thirty-two cases by HE staining and 20 cases by double labeled immunohistochemical staining were diagnosed with benign breast lesions，respectively; and 119 cases by HE staining and 121 cases by double labeled immunohistochemical staining of suspicious carcinoma cells or carcinoma cell were found．When we compared the pathological results，the accuracy rates in diagnosis of benign breast lesions with HE staining and double labeled immunohistochemical staining were 91% and 97%，respectively．The diagnostic accuracy rates of malignant breast lesions were 100% by both HE and double labeled immunohistochemical staining．Conclusion　P63 and SMA double labeled immunohistochemical staining has higher accuracy rate in diagnosis of breast cancer and it could effectively diagnose the benign breast lesions．

Key words: breast neoplasms; breast carcinoma; diagnostic tests; immunohistochemistry; P63 protein; smooth muscle actin

細胞病理學檢查技術具有快速、微創(chuàng)、安全等優(yōu)點，目前已廣泛用于乳腺腫塊的病理檢查，其對乳腺腫塊良惡性鑒別、乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)有重要價值 ［1，2］。而某些乳腺良性增生和惡性病變由于組織結(jié)構復雜、形態(tài)變異多樣和表現(xiàn)型上相互重疊，常會引起診斷上的爭議，其鑒別診斷也常需用免疫組化檢查。此外，常用的乳腺針吸法無法獲得腫瘤組織的完整結(jié)構，對診斷結(jié)果也有一定影響。2013年8月～2014年8月，我們采用P63/平滑肌肌動蛋白(SMA)雙標記法免疫組化染色以避免涂片中細胞數(shù)量和分布不同造成的結(jié)果誤差，并探討P63/SMA雙標記法免疫組化檢查對乳腺癌的診斷效能。

1　資料與方法

1．1　臨床資料　河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科收治的乳腺疾病患者150例，性別均為女性，年齡20 ～68歲。均因發(fā)現(xiàn)乳腺腫塊需做乳腺針吸檢查。121例經(jīng)病理確診乳腺癌，余29例為乳腺良性疾病。所有患者行乳腺針吸檢查前均未經(jīng)過任何治療，均有完整的術后臨床病理資料。

1．2　病變?nèi)橄俳M織的獲取　患者取坐式位，用20 mL、7號針頭注射器局部消毒，進針后乳腺腫塊部位不同深度吸取腫瘤細胞，以提高一次性成功率，將吸取的組織分成2份用95%乙醇固定備用。一份進行HE染色，光鏡下進行細胞形態(tài)學觀察與初步診斷;一份用于免疫組化染色。

1．3　P63/SMA雙標記法免疫組化染色方法及結(jié)果判定　吸取的腫瘤細胞均勻的涂在防脫片載破片上，95%乙醇固定，0．3% H 2O 2孵育，滴加一抗SMA (1∶100)室溫孵育1 h，滴加生物素化二抗，室溫孵育15 min，DAB顯色，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒判定為陽性細胞，記錄結(jié)果。后充分蒸餾水洗，0．05% HCl(pH 2．0)洗脫，枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復，滴加第二種抗體P63(1∶80)，室溫孵育1 h，滴加生物素化二抗，室溫孵育20 min，AEC顯色，以細胞內(nèi)觀察到紅色顆粒為陽性細胞。蘇木素復染核，滴加甘油明膠封固。光鏡下觀察，細胞質(zhì)呈棕黃色染色為SMA陽性，細胞核呈紅色染色為P63陽性。

2　結(jié)果

乳腺肌上皮細胞胞質(zhì)呈棕黃色染色，細胞核呈紅色染色，P63、SMA均陽性;而非肌上皮細胞胞質(zhì)清晰，胞核呈藍色，不表達P63。P63標記與間質(zhì)肌纖維母細胞和血管平滑肌細胞無交叉反應; SMA標記肌上皮細胞，與間質(zhì)肌纖維母細胞和血管平滑肌細胞有交叉反應。

150例乳腺腫物穿刺細胞學HE染色與P63/ SMA雙標記法免疫組化檢查結(jié)果:①HE涂片中32例為增生性腺上皮細胞或伴有輕、中度核異形性細胞;其中30例P63/SMA雙標記肌上皮細胞呈散在、簇狀或與上皮細胞聯(lián)結(jié)呈團狀從而初診為乳腺良性病變，余2例P63/SMA雙標記肌上皮細胞呈間斷的細索條狀而初診為可疑癌細胞。②HE涂片中119例表現(xiàn)為異型性明顯的上皮細胞或癌細胞;其P63/ SMA雙標記肌上皮細胞散在、稀少，簇狀者罕見或肌上皮消失，均初診為可疑癌細胞或找到癌細胞。

150例患者術后病理組織學檢查診斷結(jié)果: 29例良性病變者確診為腺病16例、乳腺增生性病變8例、腺肌性腺病5例，其中HE染色診斷準確率為91%，P63/SMA雙標記法免疫組化檢查的診斷準確率為97%; 121例具有惡性表現(xiàn)者病理確診為乳腺篩狀癌18例、乳腺導管癌伴浸潤78例、乳腺浸潤性導管癌25例，其中HE染色和P63/SMA雙標記法免疫組化檢查的診斷準確率均為100%。

3　討論

雙標記法免疫組化染色是在同一組織切片上同時檢測兩種抗原的免疫組化染色方法，用于多種疾病的診斷 ［3，4］。同一細胞中有兩種抗原表達的雙重染色法既可減少誤差，又便于進行對比性及相關性觀察，使獲得的結(jié)果更加客觀和準確 ［5，6］。在乳腺疾病的病理診斷工作中，乳腺肌上皮細胞的正確識別有助于良、惡性上皮性病變的鑒別。SMA標記肌上皮細胞具有較高的敏感性 ［7，8］; P63是乳腺肌上皮常用標記物 ［9，10］，有較強的特異性和敏感性，可用于乳腺病變的輔助診斷 ［11，12］。乳腺腫塊針吸檢查可為確定腫塊性質(zhì)進而為進一步手術治療提供依據(jù)，但在觀察單一HE染色涂片時，由于細胞混雜，特別是乳腺上皮細胞增生活躍時識別細胞的異型程度有些困難 ［13，14］。當在一張涂片中采用P63/SMA雙標記法免疫組化染色時，可清楚地標記出乳腺肌上皮細胞 ［15］。根據(jù)乳腺肌上皮細胞的分布及表達強弱的數(shù)目，對照HE涂片中乳腺上皮細胞的形態(tài)變化，有助于更好地鑒別乳腺良惡性病變，診斷準確率高于單行HE染色，不易誤診或漏診 ［16，17］。本研究結(jié)果顯示，乳腺肌上皮細胞同時表達P63/SMA，而非肌上皮細胞不表達P63，根據(jù)此特點，在鏡下可輕易篩選出乳腺肌上皮細胞。我們進一步對照患者手術病理結(jié)果，P63/SMA雙標記法免疫組化檢查對乳腺良性病變的確診率達97%，高于HE染色(91%)，而兩種方法對乳腺惡性病變的確診率均為100%，故認為P63/SMA雙標記法免疫組化檢查更有助于鑒別良性乳腺病變。

值得一提的是，在同一張組織切片上兩種抗原成分同時顯示時，前一種染色所用的抗體系統(tǒng)與后一種染色所用的抗體可能會發(fā)生交叉反應，形成疊加染色，影響結(jié)果的準確性。為了避免這種交叉反應，我們采用了洗脫法，其原理是在第一次染色完成后用酸性溶液(pH 2．0、0．05% HCl)洗脫涂片上形成的抗原抗體復合物，用該溶液浸染涂片30 min左右可消除第一次染色的抗體系統(tǒng)與下一次染色的交叉反應，且不破壞組織中的抗原成分，并避免洗脫液對下一步所用組織抗原的損害。我們經(jīng)反復實驗測定，發(fā)現(xiàn)pH 2．0、0．05% HCl的效果最佳，洗脫時間為30 min，洗脫后經(jīng)PBS反復沖洗，繼續(xù)完成第二種染色。

由于細胞涂片要經(jīng)過兩重的免疫組化染色，又要經(jīng)過高壓加熱處理，容易出現(xiàn)細胞脫落現(xiàn)象。因此我們建議細胞涂片后要自然晾干再固定，但也不可太干，以看到水分剛好蒸發(fā)為宜。另外細胞應涂在涂膠或硅化載玻片上，可防止其脫落。在雙標記法免疫組化染色中，兩種抗體的使用順序也很重要。我們將不需抗原修復的SMA抗體用于第一染色，將需熱修復的P63抗體用于第二染色，保證了組織對兩種抗體的親和力，且第二抗體的熱修復不會影響第一抗體的染色效果，得出的結(jié)果較為可靠。