一、PED的實驗室診斷方法

（一）病原學(xué)診斷

1.電鏡觀察法。由于PEDV和TGEV均屬于冠狀病毒，具有相似的形狀和結(jié)構(gòu)，故無法通過普通電鏡觀察進行區(qū)別，需通過免疫電鏡法（IME）進行鑒別診斷。王繼科等分別將抗原與抗體血清進行適當(dāng)轉(zhuǎn)速離心，再將其混合物離心后直接在電鏡下觀察，通過觀察有無免疫復(fù)合物粒子團集結(jié)和堆積的現(xiàn)象從而對抗原進行鑒別區(qū)分。此方法具有簡便，快速等特點，但因為該方法所用電鏡設(shè)備價格昂貴，故在條件有限的一般實驗室和養(yǎng)殖場中難以適用。

2.病毒分離培養(yǎng)。病毒的分離培養(yǎng)是將疑似感染PEDV的豬只病料經(jīng)過處理后接種到Vero細胞上，并在顯微鏡下觀察細胞有無病變。若接種后第2天觀察細胞出現(xiàn)空斑、脫落等特征，即可做出初步診斷。但這種檢測手段需結(jié)合其它手段，以保證結(jié)果可靠，另外此方法的操作程序繁雜，檢測周期長，不適用于該病的快速診斷。

（二）血清學(xué)診斷

1.微量血清中和試驗。微量血清中和試驗運用病毒與血清中存在的抗體發(fā)生特異性結(jié)合從而失去了致病力的原理，將已知抗原分別與待檢血清混合后接種到適應(yīng)抗原生長的細胞上并設(shè)置對照組排除干擾，繼而通過觀察CPE進行鑒別診斷。林志雄等建立了PED微量中和試驗, 該方法將已適應(yīng)傳代細胞生長的PEDV-G1株, 與被檢血清進行微量中和,接種到PK-15細胞作用48 h然后測抗體。此試驗方法操作步驟簡便、結(jié)果易于判定，適宜推廣使用。但由于測得血清中抗體不一定與防御有關(guān)，故陽性結(jié)果只能說明豬只接觸了傳染性病原微生物，所以該方法的鑒定結(jié)果有一定的不確定性。

1.免疫熒光法。免疫熒光法（IF）主要分為直接免疫熒光法（FAT）和間接免疫熒光法（IFAT），其中前者較為常用。崔現(xiàn)蘭等用直接免疫熒光法對發(fā)病豬的小腸切片進行檢測，結(jié)果顯示對人工方法感染PEDV的仔豬檢出率高于應(yīng)用間接免疫熒光法和電鏡觀察法對PED 陽性豬血清的檢出陽性率。林志雄等用PEDV-G1株進行直接免疫熒光法測定6個豬場155份發(fā)病仔豬腸黏膜樣品，結(jié)果檢出率為52%，而且驗證其不與其它引起豬腹瀉癥狀的病原發(fā)生交叉反應(yīng)，證明該方法特異性和準確性較高。

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）。ELISA法的特點在于檢測樣品的采集較為方便。在ELISA法原理的基礎(chǔ)上目前發(fā)展出了間接ELISA、競爭阻斷ELISA、雙抗體夾心法ELISA以及Dot-ELISA法等診斷方法。

（1）間接ELISA。國外學(xué)者Oh等將其建立的間接ELISA 法和病毒血清中和試驗進行對比，結(jié)果顯示間接ELISA 方法的特異性和敏感性均較高，表明此方法適用于PEDV的檢測。Ren等使用重組純化的M蛋白免疫家兔產(chǎn)生相應(yīng)抗體, 建立了一種檢測PEDV的間接ELISA方法。免疫熒光分析表明抗PEDV-M抗體與PEDV感染細胞發(fā)生反應(yīng)且不與其它病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，證明該方法具有良好的敏感性與特異性。

（2）競爭阻斷ELISA。此方法既可對抗原做定量的測定，也可對抗體進行檢測。國外學(xué)者Rodak L等利用制備得到的PEDV M 蛋白單抗建立了競爭阻斷ELISA診斷方法，試驗結(jié)果表明競爭阻斷ELISA具有較高的特異性和敏感性。Hou等將重組的PEDV N蛋白經(jīng)大腸桿菌表達后提取，建立了一種檢測血清中PEDV抗體的ELISA方法。

（3）雙抗體夾心法ELISA。該法是檢測抗原最常用的ELISA方法之一，適用于含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。雷利等用PEDV免疫蛋雞后收獲卵黃抗體，分離提純后得到特異性抗體，建立了酶聯(lián)免疫雙抗夾心法檢測方法。結(jié)果表明該方法具有良好的特異性和敏感性，可作為快速檢測豬流行性腹瀉病毒的一種方法。朱維正等用雙抗體ELISA 法直接檢測腹瀉病豬糞便中的抗原并將檢測結(jié)果與電鏡結(jié)果對比，其陽性符合率為97.37%，陰性符合率為100%。

（4）Dot-ELISA法。該方法是常規(guī)ELISA方法在應(yīng)用中逐漸發(fā)展出來的一種改進方法。新方法使得ELISA測定的特異性和靈敏度都有所提升，使ELISA檢測操作更加簡便和快速。陳茹等通過將PEDV抗原分離純化, 建立了斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot-ELISA)檢測PEDV抗體,與瓊脂擴散試驗的檢測結(jié)果進行對比顯示，Dot-ELISA法更為敏感,特異性強而且重復(fù)性好。

（5）商品化檢測產(chǎn)品。目前市場上商業(yè)化的PEDV檢測試劑盒主要分為抗體檢測試劑盒與抗原檢測試劑盒。抗體檢測試劑盒多用于非臨床試驗，如產(chǎn)品研發(fā)中的疫苗效果評價、某地區(qū)PEDV的流行病學(xué)檢測，養(yǎng)豬場引種篩選檢測等方面；抗原檢測試劑盒多用于疫病診斷，將采集的豬糞病料進行定性臨床測定。

（三）分子生物學(xué)診斷方法

1.PCR技術(shù)診斷。

（1）多重PCR。豬流行性腹瀉屬于病毒性腹瀉病, 而常見造成豬腹瀉的病毒還包括豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒。這三種疾病很難依靠臨床診斷進行區(qū)分，解決這個問題的常用途徑就是通過多重RTPCR技術(shù)進行診斷。張坤等分別根據(jù)PEDV M基因，TGEV N基因，GAR VP7基因的基因序列設(shè)計相應(yīng)引物，建立了一種可同時檢測以上3種抗原的多重RT-PC方法；將此方法與常規(guī)RT-PCR手段進行比較后表明，該種多重RT-PCR方法敏感性和特異性均較高，是一種可行的鑒別診斷方法。

（2）熒光定量PCR。熒光定量PCR與傳統(tǒng)的PCR方法相比操作步驟更簡便，定量更準確且污染較小，有著很好的靈敏度和可重復(fù)性。劉鄧等在PEDV N基因序列的基礎(chǔ)上設(shè)計了一對特異性的引物和探針，并利用此探針建立了檢測PEDV的TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果表明熒光定量PCR的陽性檢出率為92%，高于常規(guī)RT-PCR檢測結(jié)果。Kim S-H等根據(jù)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的特異核酸序列分別設(shè)計出相應(yīng)的引物和探針，建立了多重實時熒光定量PCR方法可用于PEDV和TGEV的定量檢測。

（3）巢式PCR。此方法利用兩套PCR引物（巢式引物）進行兩輪PCR擴增反應(yīng)，這樣做的目的在于減少錯誤擴增片段的產(chǎn)生量，所以應(yīng)用巢式PCR方法獲得的擴增產(chǎn)物特異性比較高。Ben Salem等建立了多重巢式PCR用于檢測可導(dǎo)致仔豬腹瀉的PEDV、TGEV和PRV-A，其中能檢測到的豬流行性腹瀉病毒的RNA濃度為27.2 μg/μl，可見巢式PCR檢測有著很高的靈敏度?；艚鹨鶕?jù)PEDV M的基因序列，分別設(shè)計合成針對M基因的內(nèi)、外2對特異性引物，建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法，結(jié)果顯示巢式RT-PCR方法能夠快速且準確地檢測出樣本中微量的PEDV核酸。

（4）原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)用含有放射性或非放射性的外源核酸探針與樣品中的待測DNA或RNA分子進行配對，再運用相應(yīng)的檢測手段顯示出雜交分子的所在位置。O Kim等用制備好的標記地高辛的核酸探針加入雜交緩沖液中，進行一系列處理后使其與組織切片中包含的PEDV相應(yīng)基因發(fā)生堿基互補配對，在透射電鏡下可觀察到PEDV的遺傳物質(zhì)分布。

二、豬流行性腹瀉疫苗的研究進展

1.豬流行性腹瀉組織滅活苗。1993年王明等用PEDV接種3～9日齡仔豬，然后采集發(fā)病仔豬的小腸組織和內(nèi)容物，制成氫氧化鋁滅活苗；將此疫苗經(jīng)后海穴注射免疫仔豬，保護率可達85%。但組織滅活苗存在生產(chǎn)成本高，質(zhì)量控制難度大的問題。

2.豬流行性腹瀉細胞滅活苗。馬思奇等通過向病毒培養(yǎng)液中添加適量胰酶，使PEDV適應(yīng)于Vero細胞，傳代致弱后制成氫氧化鋁滅活苗。此種方法制得的疫苗可用于PEDV疫情的預(yù)防和控制。但滅活苗存在產(chǎn)生免疫力需要周期長，不利于緊急預(yù)防接種的缺點。

3.豬流行性腹瀉細胞弱毒苗。佟有恩等通過對適應(yīng)Vero細胞的CV777株傳至第90代進行克隆純化，得到獨立穩(wěn)定和良好免疫原性的弱毒株，制成弱毒苗免疫仔豬其被動保護率達到96.2%。另外商品化的弱毒疫苗還有日本的P-5V株和韓國的KPED-9株，DR13株等，其中DR13弱毒株在韓國應(yīng)用于預(yù)防豬流行性腹瀉的口服疫苗。

4.豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗。TGE-PED二聯(lián)