張展，魏靜，張琳琳，常愛民，薛閃輝，王金銘(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

PDIA3在足月胎膜早破患者胎盤、胎膜組織中的表達(dá)及意義

張展，魏靜，張琳琳，常愛民，薛閃輝，王金銘
(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

摘要:目的觀察足月胎膜早破( tPROM)患者胎盤、胎膜組織中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3( PDIA3)的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法選擇tPROM患者30例(觀察組)、正常足月產(chǎn)婦30例(對照組)，分別采用免疫組化法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測兩組胎膜、胎盤組織中的PDIA3蛋白和mRNA。結(jié)果觀察組胎盤、胎膜組織中PDIA3蛋白陽性表達(dá)率分別為93.33%、86.67%，對照組分別為60.00%、50.00%，P均＜0.05。觀察組胎盤、胎膜組織中PDIA3 mRNA相對表達(dá)量分別為2.025±0.180、1.440±0.053，對照組分別為0.958±0.418、1.024± 0.049，兩組比較，P均＜0.05。結(jié)論tPROM患者胎盤、胎膜組織中PDIA3呈高表達(dá)，其可能參與了tPROM的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞:胎膜早破;蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3;胎膜組織;胎盤組織

胎膜早破( PROM)是指在臨產(chǎn)前胎膜自然破裂，發(fā)生于孕周≥37周者稱為足月PROM ( tPROM)，可導(dǎo)致早產(chǎn)率升高、圍生兒病死率增加、宮內(nèi)感染率及產(chǎn)褥感染率均升高等［1］。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( PDI)是一種主要存在于哺乳動(dòng)物和酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的多功能應(yīng)激相關(guān)蛋白［2］，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3( PDIA3)是該家族巰基蛋白氧化還原酶的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，未足月PROM患者胎盤組織中PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)［3］，但尚未見其在tPROM患者胎盤、胎膜組織中表達(dá)情況的報(bào)道。2014年5～12月，我們檢測了PDIA3在tPROM患者胎盤、胎膜組織中的表達(dá)水平，探討其在tPROM發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩的tPROM患者30例(觀察組)，年齡( 27.1±3.7)歲，孕( 38.6±1.9)周;初產(chǎn)婦18例，經(jīng)產(chǎn)婦12例。排除臨產(chǎn)前行人工破膜、用藥物誘導(dǎo)而致破膜、發(fā)育異?；蛘吖桥杌?、病理妊娠及不明原因引起的發(fā)熱者。另選擇同期正常足月經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦30例(對照組)，年齡( 26.6±4.1)歲，孕( 38.9±1.4)周;初產(chǎn)婦16例，經(jīng)產(chǎn)婦14例。兩組均為單活胎，剖宮產(chǎn)指征為骨盆狹窄、患者要求等。兩組均簽署知情同意書，一般資料具有可比性。

1.2樣本獲取和組織切片兩組均收集臍帶附著處母體面胎盤組織和胎膜破口處2 cm×2 cm大小的胎膜，4%甲醛溶液固定、4℃過夜，石蠟包埋后切片備用。

1.3胎盤、胎膜組織PDIA3蛋白檢測采用免疫組化法，操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行;以兔抗人PDIA3抗體( 1∶100倍稀釋)為一抗，對切片進(jìn)行染色，DAB顯色。結(jié)果判定: PDIA3蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，呈黃色顆粒狀。無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，10%～50%為2分，50%～75% 為3分，＞75%為4分;棕褐色染色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，無染色計(jì)0分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≤3者陰性，＞3者為陽性。

1.4胎盤、胎膜組織PDIA3 mRNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。利用超純RNA提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;參照Gen-Bank中人PDIA3基因序列，應(yīng)用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。PDIA3上游引物為5'-CAGCCAGCAACTTGAGGGA-3'，下游引物為5'-GTTAGTGAGATGTGAAGGACGAA-3'，擴(kuò)增片段為119 bp;以GAPDH作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件: 95℃、10 min，95℃、30 s，60℃、1 h，35個(gè)循環(huán)。mRNA的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算。操作重復(fù)3次，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用珋x±s表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及

χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組PDIA3蛋白表達(dá)比較觀察組胎盤、胎膜組織中PDIA3蛋白陽性表達(dá)率分別為93.33%、86.67%，對照組分別為60.00%、50.00%。兩組比較，P均＜0.05。

2.2兩組PDIA3 mRNA表達(dá)比較觀察組胎盤、組織中PDIA3 mRNA相對表達(dá)量分別為2.025± 0.180、1.440±0.053，對照組分別為0.958± 0.418、1.024±0.049。兩組比較，P均＜0.05。

3　討論

PDI家族是一類具有分子伴侶活性的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用的巰基—二硫鍵氧化還原酶，屬折疊酶［4］，可催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈的氧化折疊，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解途徑、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣穩(wěn)態(tài)、抗原呈遞、病毒入侵等方面起重要作用。PDIA3 是PDI家族重要成員，是一種多功能分子伴侶。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中PDIA3蛋白及mRNA水平均明顯升高，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞活力、促使內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。PDIA3與機(jī)體免疫密切相關(guān)，并且通過綁定特定的DNA片段參與應(yīng)激反應(yīng)［5］，PDIA3可直接進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類( MHC-Ⅰ)分子的肽結(jié)合槽中并與其結(jié)合，后與免疫原性多肽結(jié)合并呈遞至CD+8T細(xì)胞，活化T細(xì)胞，特異性殺傷感染細(xì)胞［6］。目前發(fā)現(xiàn)，PDIA3與血栓形成、胚胎發(fā)育、阿爾茨海默病、肥胖相關(guān)性弱精癥、子宮內(nèi)膜癌、帕金森等有關(guān)［7～10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組胎盤、胎膜組織中PDIA3表達(dá)水平明顯高于對照組。其作用機(jī)制可能為:①生殖道病原微生物上行感染或者血行感染通過胎膜、胎盤組織介導(dǎo)，引起母胎界面促炎細(xì)胞因子上升，激活基質(zhì)金屬蛋白酶活性，使膠原纖維降解。PDIA3分子可通過作用于MHC-Ⅰ分子，參與抗原提呈過程，特異性地直接殺傷被感染的細(xì)胞。②創(chuàng)傷、羊膜腔壓力升高、宮頸內(nèi)口松弛、胎兒先露部與骨盆入口銜接不好、胎膜發(fā)育不良等原因可導(dǎo)致tPROM發(fā)生，繼發(fā)性引起炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致熱休克反應(yīng)發(fā)生，合成PDIA3等多種熱休克蛋白［11］。胎盤、胎膜組織缺血、缺氧或炎癥時(shí)，可導(dǎo)致分泌蛋白過量或未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的累積，誘導(dǎo)PDIA3的表達(dá)，維持細(xì)胞必需的蛋白質(zhì)構(gòu)象，保護(hù)其生命活動(dòng)。③胎盤、胎膜組織中可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞過度凋亡可導(dǎo)致胎膜弱化、老化，最終導(dǎo)致tPROM。因此，PDIA3過表達(dá)可能參與tPROM的發(fā)生、發(fā)展，有望作為診斷PROM的一種生物標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn):

［1］劉艷.未足月孕婦胎膜早破羊膜腔封閉治療的研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2014，54( 3) : 95-97.

［2］楊拴盈，田應(yīng)選，南巖東，等.人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞雙向電泳—飛行時(shí)間質(zhì)譜研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007( 4) : 422-426.

［3］Chang A，Zhang Z，Zhang L，et al.Proteomic analysis of preterm premature rupture of membranes in placental tissue［J］.Arch Gynecol Obstet，2013，288( 4) : 775-784.

［4］Lumb RA，Bulleid NJ.Is protein disulfide isomerase a redox-dependent molecular chaperone［J］.EMBO J，2002，21( 24) : 6763-6770.

［5］Aureli C，Gaucci E，Arcangeli V，et al.ERp57/PDIA3 binds specific DNA fragments in a melanoma cell line［J］.Gene，2013，524 ( 2) : 390-395.

［6］Antoniou AN，Santos SG，Campbell EC，et al.ERp57 interacts with conserved cysteine residues in the MHC class I peptide-binding groove［J］.FEBS Lett，2007，581( 10) : 1988-1992.

［7］Zhou J，Wu Y，Wang L，et al.The disulfide isomerase ERp57 is required for fibrin deposition in vivo［J］.J Thromb Haemost，2014，12( 11) : 1890-1897.

［8］Liu Y，Guo Y，Song N，et al.Proteomic pattern changes associated with obesity-induced asthenozoospermia［J］.Andrology，2015，3( 2) : 247-259.

［9］Bhagwat SR，Redij T，Phalnikar K，et al.Cell surfactomes of two endometrial epithelial cell lines that differ in their adhesiveness to embryonic cells［J］.Mol Reprod Dev，2014，81( 4) : 326-340.

［10］Aureli C，Cassano T，Masci A，et al.5-S-cysteinyldopamine neurotoxicity: Influence on the expression of alpha-synuclein and ERp57 in cellular and animal models of Parkinson＇s disease［J］.J Neurosci Res，2014，92( 3) : 347-358.

［11］Kim SW，Lee J，Lee B，et al.Proteomic analysis in pterygium; upregulated protein expression of ALDH3A1，PDIA3，and PRDX2 ［J］.Mol Vis，2014( 20) : 1192-1202.

收稿日期:( 2015-05-03)

基金項(xiàng)目:河南省鄭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目( 131PCXTD624)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)30-0053-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R714.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.022