張虹郭子琦侯春妹李凡陳珊( 大慶師范學(xué)院，大慶，163712) ( 東北師范大學(xué))

以石油為基礎(chǔ)的化學(xué)合成塑料，如聚乙烯和聚氯乙烯等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到人類生活的各個領(lǐng)域。這種傳統(tǒng)的化學(xué)合成塑料難以降解，大量廢棄物對環(huán)境造成了嚴重的“白色污染”［1］。近年來，來源于生物并具有生物可降解性的綠色塑料受到人們的廣泛關(guān)注，其中聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)簡稱P3/4HB，為新生代(第四代)聚羥基烷酸酯類材料，被認為具有廣闊的應(yīng)用前景。

相對于傳統(tǒng)的聚β-羥基丁酸酯(PHB)，P3/4HB 有如下優(yōu)點:結(jié)晶度低、熔點低、韌性好、便于加工等［2］。而且P3/4HB 的性能可以通過調(diào)節(jié)聚合物中4HB 的含量來進行調(diào)節(jié)，據(jù)報道當P3/4HB 聚合物中4HB 的含量小于5%，其性能接近聚丙烯(PP);調(diào)節(jié)4HB 含量至9%時，其性能與高密度乙烯(HDPE)相近;而調(diào)節(jié)4HB 含量至12%時，其性能與低密度的聚乙烯(LDPE)相似［3］。目前，對于P3/4HB 的研究多集中在其合成和改性上，對其胞外生物降解的報道較少，但完善的生物降解性能評價及可控降解模式的建立，對于聚酯材料的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化至關(guān)重要。本文對P3/4HB 降解菌株進行了篩選、鑒定，并測定了其對P3/4HB 的降解特性，為進一步研究P3/4HB 的降解機理及可控轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

樣品采集自吉林市化工廠的工業(yè)廢水。

試劑:P3/4HB 購自天津國韻生物材料有限公司，分子生物學(xué)相關(guān)試劑購自Takara 生物公司，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

基本培養(yǎng)基:P3/4HB 為0．15 g、MgSO4．7H2O 為0．5 g、NH4Cl 為1 g、CaCl2．2H2O 為0．005 g、KH2PO4為4．54 g、Na2HPO4．12H2O 為11．94 g［4］。

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補水至1 000 mL。

察氏培養(yǎng)基:NaNO3為3 g、KH2PO4為1 g、Mg-SO4．7H2O 為0．5 g、KCl 為0．5 g、FeSO4為0．05 g、蔗糖為30 g、瓊脂為15 g。

菌種的篩選:將工業(yè)廢水水樣5 mL 接入基本培養(yǎng)基中，置于30 ℃，150 r/min 的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進行富集。7 d 后取上清液100 μL 涂布于以P3/4HB 為唯一碳源的乳化平板上，置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，觀察菌株的生長及透明圈形成情況，選取透明圈與菌落直徑最大的菌株為目的菌株。

菌株形態(tài)學(xué)鑒定:采用點植培養(yǎng)法觀察菌株的菌落形態(tài)和顏色，扦片法觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子穗、孢子等形態(tài)特征。檢索真菌鑒定手冊，進行菌種的初步鑒定［5］。

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定:CTAB 法提取菌株的基因組DNA 做為模板，ITS 通用引物為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，進行PCR 反應(yīng)擴增菌株基因組中保守的ITS 片段，擴增后的目的片段送生工生物公司測序，所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行同源性比對后，選取代表性菌株利用Mega4．1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌株對P3/4HB 膜的降解:將P3/4HB 粉末置于180 ℃熱壓機上預(yù)熱2 min，熱壓約5 min 之后轉(zhuǎn)移到冷壓機上，室溫自然冷卻，獲得厚度為0．1 cm的P3/4HB 薄膜。將P3/4HB 膜片(1．0 cm×1．0 cm×0．1 cm)70%酒精消毒并經(jīng)紫外燈照射后加入到滅菌的不含P3/4HB 的基本培養(yǎng)基中，接入孢子懸液，28 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)，間隔24 h 取樣，計算薄膜失重率，并將薄膜噴金后進行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

菌株底物特異性分析:分別以P3/4HB、聚3-羥基丁酸酯(PHB)、聚羥基丁酸羥基戊酸酯(PHBV)、聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)為底物制備乳化固體平板，將分生孢子點植到平板中央，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌落的直徑大小及其透明圈的形成情況。

解聚酶活力的測定:將P3/4HB 粉末溶于氯仿中，所得溶液與十二烷基磺酸鈉(SDS)混合，混合液經(jīng)超聲波破碎5 min，制得P3/4HB 乳化液，75 ℃加熱90 min 除去氯仿，得到P3/4HB 懸浮液。取3 mL P3/4HB 懸浮液加入酶液1 mL，反應(yīng)一定時間后，于650 nm 波長下測其吸收值(降低值)。一個酶活單位定義為每分鐘引起光吸收降低0．001(A650 nm)單位所需的酶量［6］。每個測試樣品設(shè)置3 個平行，以滅活酶液做空白對照。

粗酶液的制備:配制以P3/4HB 粉末為唯一碳源的液體培養(yǎng)基5 L，分裝至三角瓶中，滅菌后接入分生孢子懸液，28 ℃150 r/min 振蕩培養(yǎng)120 h，所得的發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，4 ℃，12 000 r/min 離心制得粗酶液。

最適反應(yīng)溫度的測定:將P3/4HB 乳化液分別于10、20、30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中保溫10 min，然后分別加入同樣經(jīng)過預(yù)熱的酶液，保溫30 min，測定酶在不同溫度下的酶活力。

溫度穩(wěn)定性的測定:將酶液分別置于4、10、20、30、40、50、60、70 ℃下保溫1 h 后，在酶的最適反應(yīng)溫度下檢測酶活力，繪制相對酶活力—溫度曲線。

最適反應(yīng)pH 測定:將粗酶液加入到不同pH 值的3 mL P3/4HB 乳化底物中(pH=4．0 ～6．0 為檸檬酸鹽緩沖體系，pH=6．0～8．0 為磷酸鹽緩沖體系，pH=8．0～9．0 為Tri-HCl 緩沖體系，pH=9．0 ～10．0 為甘氨酸—氫氧化鈉緩沖體系)，在酶的最適反應(yīng)溫度下測定其酶活力，繪制粗酶液的最適反應(yīng)pH 曲線。

pH 穩(wěn)定性的測定:將凍干的粗酶粉在不同pH的緩沖體系中4 ℃放置24 h 后，按照標準酶活測定方法在酶的最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測定酶活力，繪制pH 穩(wěn)定性曲線。

粗酶降解產(chǎn)物的測定:將發(fā)酵液裝入透析袋中，在蒸餾水中4 ℃過夜，以除掉酶液中的無機鹽。將透析后的酶液與P3/4HB 底物按體積比1 ∶3 的比例混合，60 ℃水浴保溫30 min，以加熱滅活的酶液做對照。產(chǎn)物離心后使用高效液相色譜四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀得到質(zhì)譜圖譜。

2 結(jié)果與分析

2．1 P3/4HB 降解菌株的篩選

將經(jīng)過富集培養(yǎng)的污水樣品稀釋涂布在P3/4HB 乳化平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d 后，可觀察到形成明顯透明圈的細菌及真菌菌落，將菌株純化后重新點種于乳化平板上，挑取透明圈與菌落直徑比值最大的一株真菌進行后續(xù)研究，命名為菌株DS0906(圖1)。

圖1 菌株在P3/4HB 乳化平板上生長且形成透明圈

2．2 菌種鑒定

該菌株在PDA 及察氏培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面平坦，成同心環(huán)狀，四周分布白色毛氈狀菌絲，隨培養(yǎng)時間的延長，菌絲的顏色由白轉(zhuǎn)綠，最后變成褐色;菌絲體成絲狀、有隔膜，分生孢子梗光滑，從壁厚而膨大的菌絲細胞上垂直生出;分生孢子頭豐富，散生，分生孢子梗頂端稍膨大形成燒瓶狀的頂囊，頂囊僅上半部產(chǎn)生孢子，分生孢子穗圓筒形，直徑約40 μm，分生孢子橢圓形，綠色。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，檢索真菌鑒定手冊可初步判斷該菌種為曲霉屬真菌［7］。

圖2 菌株菌絲體及分生孢子的顯微形態(tài)

菌株ITS 序列片段擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，ITS 片段大小約為750 bp，對其進行核苷酸測序，得到的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中與Aspergillus fumigatus strain N29 的ITS 序列同源性高達99%，在系統(tǒng)進化上非常接近(圖3)，判定該菌屬于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。

2．3 Aspergillus sp． DS0906 對P3/4HB 及其它聚酯的降解

菌株DS0906 對P3/4HB 具有高效降解能力，以乳化的P3/4HB 為碳源，培養(yǎng)過程中可觀察到培養(yǎng)液逐漸變清;以P3/4HB 粉末為碳源，可觀察到隨著菌體的生長和產(chǎn)酶，培養(yǎng)5 d 后粉末完全消失;以P3/4HB 薄膜為碳源，由于固相材料比表面積的減少，降解速率降低，培養(yǎng)的前6 d，薄膜降解速率較慢，從第7 天開始，降解速率顯著加快，14 d 后，薄膜被徹底降解成細小的碎片。利用掃描電子顯微鏡觀察P3/4HB 膜降解前后的表面形態(tài)，結(jié)果顯示，未降解的膜表面光滑;隨著降解的進行，膜表面的孔洞增加，孔徑增大，孔洞分布逐漸深入膜的內(nèi)部，呈現(xiàn)由表及里的降解趨勢(圖4)。

圖3 基于菌株ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 P3/4HB 膜被菌株DS0906 降解前后的表面SEM 照片(×2000)

將少量的Aspergillus sp． DS0906 孢子分別接種于P3/4HB、PHB、PHBV、PBS、PCL、PLA 為唯一碳源的固體平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌落的生長以及是否形成透明圈。表1 表明，菌株DS0906除了具有P3/4HB 降解能力外，還可以降解PHB、PHBV 和PBS;當以PLA 和PCL 為唯一碳源時，雖然菌株可以生長，但生長能力較弱且沒有明顯的透明圈生成，因此認為該菌株并不能有效降解高分子量的PLA 及PCL，其微弱生長可能是菌株對培養(yǎng)基中少量寡聚物利用的結(jié)果。

表1 Aspergillus sp． DS0906 在不同碳源培養(yǎng)基中的菌落直徑及透明圈產(chǎn)生情況

2．4 菌株產(chǎn)P3/4HB 解聚酶的催化特性

2．4．1 溫度對解聚酶的影響

按“粗酶液制備”方法制備粗酶液，測定酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性，結(jié)果顯示粗酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在50 ℃和70 ℃時酶活力也相對較高，達到最高酶活力的80%以上，當反應(yīng)溫度為80 ℃時，酶活力仍能達到最適反應(yīng)溫度下酶活力的78%，但在溫度40 ℃以下時，解聚酶活力較低(圖5A)。

溫度穩(wěn)定性的試驗結(jié)果顯示，PCL 解聚酶粗酶在50 ℃以下穩(wěn)定性良好，可以保留80%以上的酶活力，但隨著溫度的升高，酶活力迅速下降，60 ℃保溫1 h 后酶活力僅能殘留30%左右，而當溫度達到70℃時，保溫1 h 后酶活幾乎完全喪失(圖5B)。

2．4．2 pH 對酶活力的影響

測定PCL 解聚酶粗酶在不同pH 條件下的酶活力，結(jié)果如圖5C 所示，該酶在酸性和中性環(huán)境下具有較高的酶活力;而在堿性條件下，酶活力較低，最適反應(yīng)pH 值為6．0(檸檬酸緩沖體系)。

將等量的粗酶粉分別加入不同pH(4．0 ～10．0)的緩沖液中，4 ℃保溫24 h 后測定酶的殘余活力，結(jié)果顯示，在酸性和中性體系中，酶的穩(wěn)定性較高，在pH=4．0～8．0 范圍內(nèi)粗酶的殘余活力能夠達到最高酶活力的70%以上，當pH 大于8．0 時，酶的穩(wěn)定性迅速下降(圖5D)。

圖5 溫度和pH 對粗酶液降解P3/4HB 活力的影響

2．4．3 粗酶降解P3/4HB 的產(chǎn)物測定

使用高效液相色譜四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀繪制粗酶液降解P3/4HB 產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，結(jié)果如圖6 所示，結(jié)合分子量計算結(jié)果，可以判斷產(chǎn)物中存在羥基丁酸單體(peak 102．9)，但并沒有發(fā)現(xiàn)二聚體、三聚體及其它寡聚體，推測該P3/4HB 解聚酶是一種外切酶，每次以剪切鏈端一個羥基丁酸單元的模式發(fā)揮水解作用。

圖6 粗酶液降解P3/4HB 產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

3 結(jié)論與討論

本研究采用富集培養(yǎng)、稀釋涂布等方法從工業(yè)污水中篩選出一株可高效降解聚(3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸共聚酯)(P3/4HB)的真菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，判定該菌株屬半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科，單胞亞科，曲霉族，曲霉屬的煙曲霉，該菌株與Aspergillus fumigatus strain N29 的ITS 序列同源性高達99%，命名為Aspergillus sp．DS0906。

Aspergillus sp． DS0906 菌株對P3/4HB 及其它聚酯的降解特性研究表明，Aspergillus sp． DS0906 除高效降解聚(3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸共聚酯)外，還能夠特異性降解高分子聚酯聚3-羥基丁酸酯、聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基戊酸共聚酯)和聚丁二酸丁二醇酯，但是不能降解聚乳酸和聚ε-己內(nèi)酯。菌株發(fā)酵粗酶液的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在10～50 ℃之間酶的溫度穩(wěn)定性較好，最適反應(yīng)pH值為6．0，在pH=6．0～8．0 的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高。

Aspergillus sp． DS0906 粗酶液降解P3/4HB 的產(chǎn)物為羥基丁酸單體，推測降解酶以每次剪切一個羥基丁酸單元的外切酶模式發(fā)揮降解作用;同時，這也表明該酶為一種外切酶，但不同的單體單元(3HB或者4HB)是否對酶的識別和催化具有影響作用還需要進一步的研究。

現(xiàn)階段，對P3/4HB 生物降解的研究主要是利用生物堆肥或者利用PHB 解聚酶進行降解［8-9］，而關(guān)于P3/4HB 降解菌株篩選的研究很少。因此，本文從工業(yè)廢水中篩選出的高效降解P3/4HB 的真菌菌株，是P3/4HB 的降解機制研究的重要補充。為P3/4HB 解聚酶的分離純化，以及該類降解酶與PHB 解聚酶結(jié)構(gòu)和功能的比較，從而全面的闡明P3/4HB 的降解機制等工作做好準備。

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