厚凌宇 田兆豐 謝響明

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所) (北京林業(yè)大學(xué))

紫莖澤蘭(Eupatorium adenophrum)是一種嚴(yán)重危害環(huán)境的世界性惡性雜草。約在20 世紀(jì)40 年代傳入我國(guó)，是國(guó)家環(huán)保局公布的我國(guó)首批16 種外來入侵性有害生物之一，其入侵性位居前列［1］。由于該外來入侵生物的抗逆性強(qiáng)，其體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì);因此，利用其活性物質(zhì)開發(fā)生物農(nóng)藥，既可以變廢為寶，還可以減少環(huán)境污染，具有重大的社會(huì)、生態(tài)及經(jīng)濟(jì)效益［2］。

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)引起的煙草花葉病，是影響煙草生產(chǎn)的首要病害，染病煙草煙葉質(zhì)量等級(jí)和產(chǎn)量下降嚴(yán)重。在我國(guó)南方煙草種植地區(qū)，田間發(fā)病率一般可達(dá)5%～20%，早期發(fā)病的損失可達(dá)50%～70%，甚至失收［3］?；瘜W(xué)藥劑，是目前防治煙草花葉病毒病的一種重要的措施，但化學(xué)藥劑的濫用會(huì)造成環(huán)境污染以及嚴(yán)重影響產(chǎn)品安全。因此，篩選、研制對(duì)人畜安全，并且環(huán)境友好的生物農(nóng)藥，已成為當(dāng)今社會(huì)人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

植物擁有極其復(fù)雜的防御機(jī)制，以抵抗病原體侵害。在幾分鐘內(nèi)病原體就會(huì)被寄主引發(fā)的一系列反應(yīng)所識(shí)別，比如，離子流跨過細(xì)胞質(zhì)膜、pH 的改變、細(xì)胞質(zhì)膜的去極化、活性氧的產(chǎn)生［4-5］。在幾小時(shí)之內(nèi)，這些變化之后就會(huì)誘導(dǎo)寄主組織產(chǎn)生水楊酸、茉莉酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物，與防御相關(guān)的基因會(huì)被激活且伴隨著細(xì)胞壁的僵化，植物合成抗毒素并且可以激活病程相關(guān)蛋白［6-7］。病程相關(guān)基因的激活，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗性，保護(hù)植物沒有被病害侵染的部位免受侵害［8］。這種抗性反應(yīng)，同樣可被一類稱為激發(fā)子的物質(zhì)所誘導(dǎo)［9］。

紫莖澤蘭多糖(EAP)，是本研究從紫莖澤蘭葉中分離得到的一種植物多糖。經(jīng)前期探究表明，紫莖澤蘭總提取物具有對(duì)多種病原真菌的抑制作用［2］。該糖具有潛在的激發(fā)子活性，可誘導(dǎo)植物提高對(duì)煙草花葉病毒的抗性。本研究利用半葉枯斑法，確定了EPA 對(duì)TMV 侵染煙草葉片的預(yù)防作用，分析了紫莖澤蘭多糖提高煙草抗TMV 的機(jī)理，旨在為開發(fā)安全、高效的抗植物病原病毒制劑提供參考。

1 材料和方法

1．1 材料

供試植物:試驗(yàn)用紫莖澤蘭(Eupatorium adenophrum)樣品采自云南省，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。鮮葉陰干處理后，60 ℃烘干至恒質(zhì)量;粉碎機(jī)粉碎后過40 目篩，得到的粉末于4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

供試毒源:煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。稱取1 g 感病葉片，加10 倍量0．01 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7．0)，充分研磨，離心后取上清作為接種液。

供試寄主植物:三生煙(Nicotiana tabacum cv．Samsun NN)栽種于溫室中，于25 ℃光照培養(yǎng)16 h;然后于16 ℃黑培養(yǎng)暗8 h;待幼苗長(zhǎng)至8 葉期時(shí)(第七葉完全展開)，選取生長(zhǎng)一致的煙草進(jìn)行試驗(yàn)。

1．2 主要試劑與儀器

試驗(yàn)儀器，主要包括UNIC UV-2102C 分光光度計(jì)、ABI 7500s 型熒光定量PCR 儀、SIGMA 3-30K高速冷凍離心機(jī)等。

半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖，均為Sigma進(jìn)口分裝(分析純);總RNA 提取TRIzol 試劑，為美國(guó)Invitogen 公司產(chǎn)品;合成第一鏈cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Super Mix，購(gòu)自北京全式金公司。用于熒光定量檢測(cè)引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3 紫莖澤蘭多糖的制備

取紫莖澤蘭水提取液200 mL，利用Sevage 法除蛋白3 次;上清液用2 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)至pH=7;加熱回流用1%活性炭脫色;抽濾，濾液扎袋，流水透析48 h。透析液離心(3 000 r/min)10 min;上清于80 ℃水浴濃縮至原體積的1/3，然后加入3 倍體積的95%乙醇;攪拌均勻后，3 000 r/min 離心15 min;沉淀用無水乙醇洗滌2 次，乙醚洗滌1 次，真空干燥得到多糖粗品。

將上述粗品稱量后，用其質(zhì)量體積比為100 倍體積的熱水復(fù)溶;離心去除不溶物后，加2%CTAB，至沉淀完全溶解;攪勻，靜置4 h，于4 000 r/min 離心10 min，去清液。沉淀用熱水洗3 次，收集沉淀并稱質(zhì)量。稱量后的沉淀用其質(zhì)量體積比為100 倍體積的2 mol·L-1NaCl 于60 ℃水浴解離4 h，解離后離心裝袋透析，12 h 后放出透析液，于80 ℃濃縮后，加3 倍體積的95%乙醇，靜置4 ～6 h，離心收集沉淀;沉淀用無水乙醇洗滌2 次，乙醚洗滌1 次。沉淀干燥存放［10］。

1．4 紫莖澤蘭多糖的鑒定及總糖量測(cè)定

利用Molisch 反應(yīng)(α-萘酚反應(yīng))鑒定紫莖澤蘭多糖。糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與α-萘酚作用，形成紅紫色復(fù)合物。由于在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)紅紫色的環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。

紫莖澤蘭多糖溶液1．0 mL 加入蒸餾水1．0 mL，再加苯酚試液1．0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5．0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。先顯示紫環(huán)，煮沸后顯紫紅色。

精密量取1 g·L-1的葡萄糖對(duì)照品溶液0．05、0．25、0．75、1．00、1．25 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，加水稀釋至10 mL。準(zhǔn)確加入5%的苯酚溶液1 mL，混勻，冰水浴;再精密加入濃硫酸5 mL 后98 ℃水浴加熱20 min，自來水水浴冷卻5 min，室溫放置10 min;以空白溶液為對(duì)照，于488 nm 處測(cè)吸光度。以吸光度(A)對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸。吸取10 mg·L-1的樣品液1 mL，測(cè)定吸光度，多次測(cè)量取平均值，通過回歸方程求得相應(yīng)糖質(zhì)量濃度值，計(jì)算總糖量。

1．5 利用薄層層析(TLC)法對(duì)紫莖澤蘭多糖主要成分檢測(cè)

精密稱取多糖樣品15 mg，置10 mL 具塞試管中，加水1 mL。加熱溶解，再加入2 mol·L-1三氟乙酸溶液2 mL，搖勻，密封。將其放入烘箱中，100 ℃加熱水解8 h［11］;取出，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，用2 mol·L-1氧化鈉中和至pH 約7．0。至刻度，搖勻，備用。展開劑選用V(正丁醇)∶V(丙酮)∶V(pH 為5 磷酸緩沖液)= 4 ∶5 ∶1 的溶液。顯色劑選用“苯胺-二苯胺-磷酸”顯色。

試驗(yàn)在密閉的層析缸中進(jìn)行。首先，將展層劑倒入缸內(nèi)，待缸內(nèi)被展層劑蒸汽飽和;然后，將點(diǎn)好樣的薄層板底邊向下輕輕斜置缸內(nèi)溶劑中，密封好層析缸即可。溶劑前沿距薄板上端約2 cm 處時(shí)，取出板并晾干。將顯示劑倒入白色瓷盤中，把晾干的硅膠板浸入盤中，顯示劑需沒過硅膠板，約1 min后，取出置于烘箱中85 ℃烘20 min，取出冷卻至室溫。記錄各斑點(diǎn)至原點(diǎn)的距離。

比移值(Rf)= 原點(diǎn)至組分斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離。

1．6 半葉枯斑法檢測(cè)紫莖澤蘭多糖對(duì)TMV 侵染煙草葉片的預(yù)防作用

選長(zhǎng)勢(shì)一致的8 葉期三生煙，剪去從上往下數(shù)第4 至第6 片真葉，選取大小一致、葉片左右均勻的葉片，按順序放在鋪有濕潤(rùn)紗布的白磁盤中。取1 mL 提取物接種左半邊葉片;取1 mL 蒸餾水接種右半邊葉片;15 min 后沿葉脈噴適量的石英砂，造成葉面創(chuàng)傷;在兩邊分別接種1 mL 病毒。每處理接種8片葉片，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，25 ℃、10 000 lx 下培養(yǎng)3～4 d 后觀察，記錄枯斑的數(shù)目，并計(jì)算抑制率。抑制率=((對(duì)照平均枯斑數(shù)-處理平均枯斑數(shù))/對(duì)照平均枯斑數(shù))×100%。

1．7 紫莖澤蘭多糖對(duì)煙草防御性酶活性測(cè)定

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致8 葉期時(shí)(第七葉完全展開)的盆栽煙草。將5 g 粗多糖溶于50 mL 蒸餾水中，分別用5 mL 粗多糖進(jìn)行葉面噴施;陰性對(duì)照和陽性對(duì)照煙草噴施蒸餾水;48 h 后重復(fù)處理1 次;處理后24 h后接種病毒，分別于接種病毒后的1、2、3、4、5、6 d取葉片進(jìn)行酶活測(cè)定。稱取煙草葉片約0．3 g，加入2 mL PBS 緩沖液(0．5 mol·L-1，pH=7)充分研磨成勻漿，再加入2 mL PBS 緩沖液清洗轉(zhuǎn)入離心管中，4℃靜置20 min，12 000 r·min-1離心25 min，取上清液作為酶提取液備用。

過氧化物酶(POD)的活性測(cè)定，參照喬富廉［12］的方法，以每分鐘OD470變化0．01 的酶量定義為1個(gè)酶活性單位。多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定，參考高勇等［13］的方法，以O(shè)D410每分鐘內(nèi)變化0．01 的酶量作為1 個(gè)酶活性單位。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定，采用氮藍(lán)四唑比色法。

1．8 紫莖澤蘭多糖誘導(dǎo)煙草病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)檢測(cè)

為探究PRs 在EAP 誘導(dǎo)煙草抗性反應(yīng)中潛在的作用，用RT-qPCR 方法對(duì)EAP 誘導(dǎo)PRs 的表達(dá)進(jìn)行研究。

取接種病毒后的1、2、3、4、5、6 d 的煙草葉片，在液氮中研磨粉碎后取50 ～100 mg 粉末，用TRIzol試劑提取總RNA;提取步驟，參照操作說明書進(jìn)行。取1 μg 提取的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。利用Premier 5 軟件設(shè)計(jì)基因特異片段擴(kuò)增引物(見表1)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。RT-qPCR 反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。并在全部循環(huán)結(jié)束后制作融解曲線，檢測(cè)是否有引物二聚體生成。以EF-lα 基因作為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法［14］計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)3 個(gè)重復(fù)。并且以未反轉(zhuǎn)錄RNA 樣品作為對(duì)照，防止DNA 污染。

表1 RT-qPCR 擴(kuò)增基因特異片段引物序列

1．9 數(shù)據(jù)分析

預(yù)防作用抑制率、酶活性、熒光實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)計(jì)算，基于非線性回歸分析;原始數(shù)據(jù)，使用GraphPad PRISM?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì);用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 紫莖澤蘭多糖質(zhì)量濃度

紫莖澤蘭多糖經(jīng)過Molisch 反應(yīng)，在試管中有紫環(huán)形成(見圖1)。以吸光度(A)對(duì)紫莖澤蘭多糖質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，方程為C=0．185A-0．008(R2=0．995)。結(jié)果表明，紫莖澤蘭多糖的總糖質(zhì)量濃度為21．53 g·L-1。

圖1 紫莖澤蘭多糖Molisch 反應(yīng)

2．2 紫莖澤蘭多糖的主要成分

如圖2 所示，計(jì)算各個(gè)樣品的比移值(Rf)，結(jié)果如下:Rf半乳糖= 0．67;Rf木糖= 0．74;Rf果糖= 0．68;Rf葡萄糖=0．64;Rf甘露糖=0．71;RfA=0．70;RfB=0．65。

紫莖澤蘭多糖經(jīng)過三氟乙酸酸解后，經(jīng)過薄層層析結(jié)果顯示，有2 種主要的成分，經(jīng)過對(duì)Rf值的計(jì)算得出，這2 種主要成分即為甘露糖(A)、葡萄糖(B)。

圖2 紫莖澤蘭多糖的薄層色譜圖

2．3 紫莖澤蘭多糖在煙草上對(duì)TMV 的預(yù)防效果

利用半葉枯斑法對(duì)煙草離體葉片進(jìn)行摩擦接種后，可觀察到施用紫莖澤蘭多糖的左半葉枯斑數(shù)明顯少于右半葉施用蒸餾水的(見圖3)，并且統(tǒng)計(jì)3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的EPA 處理的煙草葉片枯斑數(shù)(見表2)。結(jié)果表明:紫莖澤蘭多糖對(duì)TMV 侵染有良好的預(yù)防作用，尤其當(dāng)EPA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，預(yù)防效果最佳(為82．79%)。

圖3 紫莖澤蘭多糖在煙草上對(duì)TMV 的預(yù)防效果

表2 紫莖澤蘭多糖在煙草上對(duì)TMV 的預(yù)防效果

2．4 紫莖澤蘭多糖對(duì)煙草中各防御酶活性的影響

由表3 可見:經(jīng)測(cè)定，紫莖澤蘭多糖處理過的煙草植株多酚氧化酶(PPO)酶活在第4 天達(dá)到最高，是水處理組(WT)的3．54 倍，而且水處理組PPO 酶活一直高于陰性對(duì)照組。過氧化物酶(POD)酶活在第3 天達(dá)到最高，分別是水處理組及陰性對(duì)照組的1．59、1．30 倍。紫莖澤蘭多糖處理過的煙草植株，POD 酶活一直高于水處理組及陰性對(duì)照組。超氧化物歧化酶(SOD)，是催化O2-歧化作用生成H2O2和O2［15］，表3 中SOD 酶活性最高出現(xiàn)在第2 天，是水處理組的2．69 倍。研究結(jié)果顯示，紫莖澤蘭多糖可以有效的誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生防御性酶，以抵抗植物病毒侵染。

表3 紫莖澤蘭多糖對(duì)系統(tǒng)宿主防御性酶的影響U·min-1·g-1

2．5 紫莖澤蘭多糖誘導(dǎo)病程相關(guān)基因PR-1α、PR-3、PR-5 的表達(dá)

PRs 的表達(dá)是植物產(chǎn)生植株系統(tǒng)獲得抗性的標(biāo)志［16-19］。在植物體中PR 蛋白分為酸性和堿性2類;通常情況下，酸性PR 蛋白在細(xì)胞外累積，參與SA 信號(hào)途徑介導(dǎo)的植物抗性。在本研究中，EAP能夠誘導(dǎo)酸性PR 蛋白PR-1α、PR-3、PR-5 在煙草葉中表達(dá)(見表4)，PR-1α、PR-3、PR-5 都在EAP處理后5 d 達(dá)到最高峰，PR-1α 是水處理組及陰性對(duì)照組的5．27、12．06 倍;PR-3 是水處理組及陰性對(duì)照組的7．93、26．31 倍;PR-5 是水處理組及陰性對(duì)照組的5．60、8．09 倍。

3 結(jié)論與討論

植物病毒對(duì)植物屬專性寄生，植物病毒一旦侵入植物，很難將其鏟除［18］，所以需采用預(yù)防為主、綜合防治的策略進(jìn)行植物病毒的防治工作。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過一些激發(fā)子(如水楊酸、香菇多糖等)誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性［20］。

當(dāng)植物遭受病原體侵染后，在病原體的侵染位點(diǎn)常會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)形成枯斑;而在非侵染部位，通常會(huì)誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性的發(fā)生。EAP 處理后的煙草植株，當(dāng)侵染TMV 后，可以明顯抑制TMV 在煙草體內(nèi)的增殖，提高處理煙草對(duì)TMV 的抗性。

表4 紫莖澤蘭多糖處理后煙草PR 蛋白基因的表達(dá)

植物擁有極其復(fù)雜的防御機(jī)制，以抵抗病原體侵害。在植物受到病原體侵染后會(huì)激發(fā)系統(tǒng)獲得抗性，這一過程可以在短時(shí)間之內(nèi)誘導(dǎo)煙草體內(nèi)防御性的酶(CAT、PAL、SOD)活性顯著增強(qiáng)［21］。酸性PR 基因的表達(dá)，常被視作可以誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性發(fā)生的標(biāo)志。

本研究結(jié)果證明:EAP 可以激發(fā)煙草體內(nèi)防御性的酶(CAT、PAL、SOD)活性顯著增強(qiáng)，以及促進(jìn)抗病相關(guān)蛋白基因(PR-1α、PR-3、PR-5)在煙草葉片中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。證明EAP 可誘導(dǎo)提高植物對(duì)TMV 的抗性，其誘導(dǎo)提高植物抗病性機(jī)制，在于EPA 通過水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)了植物系統(tǒng)獲得抗性的發(fā)生，由此為EAP 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考，為進(jìn)一步研究煙草抗TMV 奠定了基礎(chǔ)。

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