張雪輝 唐蕊 孟春燕

摘要：對纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化研究，以期得到最佳培養(yǎng)條件，并在理論上豐富纖維素酶的研究材料，在實踐中指導纖維素酶的生產(chǎn)應(yīng)用。利用單因素法對培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值、接種量和裝液量進行研究，并通過DNS法測定不同溶液在540 nm處的吸光度，間接計算出酶活性。結(jié)果表明，纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11最佳培養(yǎng)條件為30 ℃、初始pH值為7、裝液量60%、接種量25%、140 r/min振蕩培養(yǎng)120 h。試驗初步確定了纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11的培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；纖維素酶產(chǎn)生菌；酶活性；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

中圖分類號： Q9399文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0399-02[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-21

作者簡介：張雪輝（1976—，男，河北邢臺人，碩士，副教授，從事應(yīng)用微生物教學與研究工作。Tel：（03193898060；E-mail：xtxyzxh@126com。

植物每年通過光合作用，可以產(chǎn)生大于100億t的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素。人類活動產(chǎn)生的廢棄物中也含有大量的纖維素，但其中只有極少部分為人們所利用，造成資源的巨大浪費。隨著化石燃料的短缺和枯竭，能源問題已成為人類面臨的共同問題，尋找新能源是人類亟待解決的問題。微生物纖維素酶恰可以利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化成簡單糖，再由酵母菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)，緩解世界性能源危機，并避免化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境污染問題，在可再生資源利用方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景[1-5]。此外，纖維素酶還被廣泛地應(yīng)用在食品、釀造、飼料加工、紡織、洗衣等多個領(lǐng)域[6]。

目前，纖維素酶主要來源于3個方面：微生物、動物和植物，而微生物是其最主要的來源。纖維素酶活性較低，且容易受到培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值等多種因素的影響，這成為阻礙其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸問題[7]，因此研究影響酶活的各個因素對提高纖維素酶活具有重要意義。本試驗對纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化研究，以期得到最佳培養(yǎng)條件，并在理論上豐富纖維素酶的研究材料，在實踐中指導纖維素酶的生產(chǎn)應(yīng)用。

1材料與方法

11材料

111試驗材料

1111菌種纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11（邢臺學院微生物實驗室保存菌種。

1112培養(yǎng)基

（1 液體富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂02 g，[JP2]氯化鈉10 g，水1 000 mL，pH值為7[8]。（2 液體優(yōu)化培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂02 g，氯化鈉10 g，水1 000 mL。

12方法

121葡萄糖標準曲線的繪制取1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、02、04、06、08、10、12 mL分別加入到7只試管中，用蒸餾水補加到2 mL，再加入15 mL DNS試劑。在沸水浴中煮沸5 min后流水冷卻，加蒸餾水至25 mL，充分混勻，以未加入葡萄糖溶液的空白管作對照，分別于540 nm波長下測定各溶液的吸光度，并記錄各吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

122粗酶液的制備菌種接種后分別置于不同的條件下培養(yǎng)，4 d后取菌液用漏斗過濾，其濾液即為粗酶液。

123酶活性的測定參照文獻[9]采用DNS法測定酶活性。

124培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單因素試驗方法，在裝有定量培養(yǎng)基的錐形瓶中接入定量菌液，在不同培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值、接種量、裝液量的條件下培養(yǎng)4 d，取酶液測其酶活性[10-11]。

2結(jié)果與分析

21葡萄糖標準曲線

所繪葡萄糖標準曲線如圖1所示。回歸方程為y=0622 3x-0014 3，r=0999 5，此標準曲線可用。

[F（W9][TPXH1tif][F]

22培養(yǎng)條件的優(yōu)化

221培養(yǎng)方式對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同培養(yǎng)方式下的酶活性變化情況如圖2所示。由圖2可知，纖維素酶活性在靜置培養(yǎng)時達到498 U/mL；80 r/min振蕩培養(yǎng)時達到485 U/mL；在80～140 r/min范圍內(nèi)振蕩培養(yǎng)時酶活性逐漸增大，而在140 r/min時達到最大值 1 013 U/mL；之后轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，使得菌絲斷裂，導致酶活降低。由此可知，菌株JW-11的最適培養(yǎng)方式是140 r/min振蕩培養(yǎng)。

222培養(yǎng)溫度對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同培養(yǎng)溫度下的酶活性變化情況如圖3所示。由圖3可知，纖維素酶活性在24～30 ℃范圍內(nèi)逐漸增大，在30 ℃時達到最大值563 U/mL；之后隨著溫度升高，菌體生長受到影響，導致酶活降低。由此可知，菌株JW-11產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度是30 ℃。

223培養(yǎng)時間對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同培養(yǎng)時間下的酶活性變化情況如圖4所示。由圖4可知，纖維素酶活性在培養(yǎng)24 h后達到102 U/mL；在培養(yǎng) 24～96 h 范圍內(nèi)逐漸增大；在培養(yǎng)96～120 h時間內(nèi)驟然增大，且在培養(yǎng)120 h后達到了最大值6 371 U/mL；之后隨著培養(yǎng)時間延長，產(chǎn)生了較多的次級代謝產(chǎn)物而不利于菌體生長，因此酶活降低。由此可知，菌株JW-11產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)時間是120 h。[FL]

[F（W9][TPXH3tif][F]

[FL（22]224初始pH值對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同初始pH值下的酶活性變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株在初始pH值為5的培養(yǎng)基培養(yǎng)時酶活性達到 2 894 U/mL；之后隨著pH值增大，產(chǎn)酶條件越來越合適，酶活性越來越高，且在pH值為7時達到最大值5 353 U/mL；而后pH值繼續(xù)增大則不利于菌體的生長，酶活降低。由此可知，菌株JW-11產(chǎn)酶的最適初始pH值為7。

[F（W10][TPXH5tif][F]

225接種量對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同接種量下的酶活性變化情況如圖6所示。由圖6可知，接種量為125%時纖維素酶活性達到5 521 U/mL；在接種量為250%時達到最大值5 650 U/mL；而在接種量375%～625%范圍內(nèi)，隨著接種量增大，酶活降低。由此可知，菌株JW-11產(chǎn)酶的最適接種量為25%。

226裝液量對纖維素酶活性的影響

菌株JW-11在不同裝液量下的酶活性變化情況如圖7所示。由圖7可知，裝液量為30%～50%時，所產(chǎn)酶活性變化不大，且在50%時稍有降低；之后隨著裝液量增大酶活性明顯升高，并在60%時達到最大值3 447 U/mL；而后裝液量繼續(xù)增大，酶活性降低。由此可知，菌株JW-11的最適裝液量為60%。

3結(jié)論與討論

本試驗利用單因素法對纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11進行

[F（W10][TPXH6tif][F]

[F（W10][TPXH7tif][F]

液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，并通過DNS法間接測定了不同條件下的酶活性，最終經(jīng)分析比較得出其最佳培養(yǎng)條件為初始pH值為7、60%裝液量、25%接種量、30 ℃下以140 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)120 h。該試驗充分說明了纖維素酶產(chǎn)生菌所產(chǎn)酶活性受多種因素的影響，與湯斌等的研究結(jié)論[11-12]一致。本試驗雖得出了纖維素酶產(chǎn)生菌JW-11培養(yǎng)的最優(yōu)條件，但由于只設(shè)計了單因素試驗而并未進行正交試驗，忽略了各個條件之間的影響，只能說為該菌株今后的開發(fā)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

另外，要想將菌株JW-11應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，還需從以下幾個方面進行深入的研究：進行菌種的鑒定；利用基因工程[CM（25]技術(shù)將目的菌株JW-11編碼纖維素酶的基因?qū)虢湍竅CM]

[FL]

[H4D]

菌體內(nèi)，并使其表達，實現(xiàn)酵母菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)；探究菌株JW-11與其他菌株混合發(fā)酵對酶活的影響。相信隨著生物化學、分子生物學及基因工程等多種交叉學科的快速發(fā)展，人們對纖維素酶的研究會越來越深入，獲得高比活力的纖維素酶，并將之更好地應(yīng)用于環(huán)境、能源、食品、紡織等領(lǐng)域終將成為現(xiàn)實。

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