廖瀚峰 周禮紅 潘肇儀 高燕燕 韋名科

摘要：為了篩選同時具有除臭和產纖維素酶能力的菌株，采用濾紙崩解試驗初篩篩選到6株具有產纖維素酶能力的菌株，通過用DNS法測定其濾紙酶、內切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活進行復篩，最終篩選到具有較高產纖維素酶能力的菌株G2，其酶活力分別為1737、3179、1232 IU/mL。通過形態(tài)學觀察及16S rDNA分子鑒定，初步確定該菌株為淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，從而為微生物除臭菌劑的制備提供了菌種資源。

關鍵詞：纖維素酶；濾紙崩解試驗；篩選鑒定；16SrDNA

中圖分類號： X173文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0386-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-01-13

作者簡介：廖瀚峰（1989—，男，廣西桂林人，碩士研究生，從事微生物菌劑研究。E-mail：5851122lhf@163com。

通信作者：周禮紅，博士，副教授，從事微生物研究。E-mail：Lhzhou33@126com。

垃圾處理是當代世界各國共同關注并亟待解決的環(huán)境問題之一，也是城市發(fā)展與健康領域中的一項重要研究內容。我國城市生活垃圾年清運量約為16億t，除少部分焚燒、堆肥或回收利用外，絕大部分被運送到填埋場進行填埋處置，在填埋過程中由于有機質腐敗分解，不可避免地造成惡臭污染[1-2]。城市突發(fā)性惡臭污染越來越嚴重，嚴重干擾了人們的正常生產生活，投訴量不斷攀升[3-4]。近些年來，在北京、上海、杭州、廣州等一些大中城市發(fā)生的垃圾填埋場惡臭擾民事件，成為填埋場周邊地區(qū)的社會不穩(wěn)定因素，嚴重制約我國經濟、社會和環(huán)境的持續(xù)發(fā)展。

我國城市垃圾比較特殊，垃圾中有機物占主要成分，主要有淀粉、蛋白質、脂類、纖維素、半纖維素、木質素等。其中木質素難以被微生物降解[5]；纖維素和半纖維素因為具有緊密的結晶結構，使其具有很強的不可降解性，積累過多會導致環(huán)境問題。城市生活垃圾中有大量纖維素，且隨著人們生活水平提高而呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[6]。所以纖維素和半纖維素的處理也是生物法處理城市垃圾的關鍵環(huán)節(jié)之一[7]。篩選出同時具備分解纖維素和快速除臭能力的菌株對于采用生物法處理城市垃圾尤為重要。本研究通過篩選出具有產纖維素酶能力的快速除臭菌株，以期為提高生物法處理城市垃圾效率、微生態(tài)除臭提供更多的微生物菌種資源。

1材料與方法

11材料

111供試菌株供試菌株為貴州大學生命科學學院微生物實驗室保存的16株具有快速發(fā)酵及一定除臭功能的菌株（分別編號為G1、G2、G3、G4、G5、X1、X2、X3、X4、X5、X6、F1、F2、F3、Y1、Y2。

112試劑DNS試劑[8]、005 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值85、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制的1 % 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na溶液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制的1%水楊苷溶液、蒸餾水。

113培養(yǎng)基（1濾紙崩解培養(yǎng)基：05 g MgSO4，2 g H2PO4，05 g Cl，0001 g FeSO4·7H2O，10 g酵母膏，1 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水，自然pH值。（2發(fā)酵產酶培養(yǎng)基：10 g CMC-Na，05 g MgSO4，2 g 2HPO4，05 g Cl，001 g FeSO4·7H2O，5 g[JP2]酵母膏，05 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水，pH值為72～74。（3菌種活化培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，16 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH值為72。

114主要設備與儀器S1000 PCR擴增儀，美國伯樂 BIO-RAD 公司生產；DYY-11型電泳儀，北京市六一儀器廠生產；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂BIO-RAD公司生產；TH2-82A數顯氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器有限公司；Olympus生物顯微鏡，奧林巴斯株式會社。

12方法

121種子液的制作將供試菌株轉接到用250 mL三角瓶裝的100 mL液體菌種活化培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液。

122濾紙崩解試驗將活化后的供試菌株接種到用 250 mL 三角瓶裝的150 mL濾紙崩解培養(yǎng)基中，再加入1條15 cm×80 cm滅菌過后的Whatman No1濾紙條，同時設立不接任何菌株的空白對照C，在37 ℃、160 r/min下培養(yǎng)；間隔 72 h 后，觀察濾紙片的崩解情況，并選出濾紙崩解效果明顯的菌株，測定其濾紙酶、內切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的酶活。

123粗酶液的提取將濾紙崩解效果明顯的菌株從試管斜面轉接至發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng) 48 h，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。

124濾紙酶活的測定[9] 在試管中放入1 cm×6 cm的Whatman NO1濾紙（約50 mg1條，加入05 mL適當稀釋的纖維素酶粗酶液以及1 mL 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，45 ℃ 溫浴60 min后，立即加入3 mL DNS試劑終止反應，沸水浴 5 min 后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，在540 nm扣除空白測吸光度，根據葡萄糖標準曲線換算成IU/mL?？瞻坠艿拇置敢合扔梅兴?0 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個濾紙酶活力單位定義為：以濾紙為底物，在45 ℃恒溫的條件下，水解反應中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

125內切葡聚糖苷酶的測定在試管中加入05 mL適當稀釋的纖維素酶粗酶液和2 mL 1% CMC-Na溶液作為底物，45 ℃溫浴30 min后，立即加入3 mL的DNS試劑終止反應，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，冷卻后在540 nm扣除空白測吸光度，根據葡萄糖標準曲線換算成IU/mL。空白管的粗酶液先用沸水水浴10 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個內切葡聚糖苷酶活力單位定義為：以1%CMC-Na為底物，在 45 ℃ 恒溫的條件下，水解反應中1 min催化底物水解形成 1 μmol 葡萄糖的酶量。

126β-葡萄糖苷酶的測定在試管中加入05 mL適當稀釋的纖維素酶粗酶液和2 mL 1%水楊苷溶液作為底物，45 ℃ 溫浴60 min后，立即加入3 mL的DNS試劑終止反應，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，冷卻后在540 nm扣除空白測吸光度，根據葡萄糖標準曲線換算成IU/mL。空白管的粗酶液先用沸水水浴10 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個β-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為：以1%水楊苷為底物，在 45 ℃ 恒溫的條件下，水解反應中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

12716S rDNA 序列分析采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式基因組 DNA 抽提試劑盒（細菌提取。

PCR 反應體系（ 25 μL：125 μL Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×；1 μL 16S上游通用引物27F；1 μL 16S下游通用引物1492R；95 μL ddH2O；1μL模板DNA。

上游通用引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游通用引物1492R序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應條件為：94 ℃，4 min；94 ℃預變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃停止。

PCR 產物由生工生物工程上海股份有限公司使用Applied Biosystems 3730XL測序儀進行測序。將所得序列通過 NCBI的BLAST功能進行序列比對分析。利用MEGA 50軟件制作系統(tǒng)進化樹。

2結果與分析

21初篩試驗結果

通過濾紙崩解試驗，從供試菌中篩選具有產纖維素酶能力的菌株。將16株供試菌接入有無菌濾紙條的濾紙崩解培養(yǎng)基后72 h觀察結果?？瞻捉M濾紙條保持完整，邊緣沒有崩解情況。菌株F1對濾紙條產生一定程度的崩解效果，濾紙發(fā)生斷截并且邊緣呈絮狀，但總體保持完整。菌株Y6、X1、X4、G1均對濾紙產生明顯的崩解效果，培養(yǎng)基渾濁且底部有部分絮狀物，推測是濾紙條完全崩解后產生的沉淀物。菌株G2對濾紙條表現(xiàn)出較為徹底的崩解效果，培養(yǎng)基相對于其他菌株較為澄清，底部只有少量絮狀殘留物。Y1等其余10株供試菌株沒有明顯的濾紙崩解現(xiàn)象（圖1。[FL]

[F（W11][TPLHF1tif][F]

[FL（22]22復篩試驗

將濾紙崩解作用明顯的6個菌株用液體產酶培養(yǎng)基發(fā)酵2 d后測定其濾紙酶、內切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。根據濾紙崩解和酶活力測定結果篩選出具有較高纖維素酶活力的菌株。在45 ℃、pH值85條件下，G2的濾紙酶活性和內切葡聚糖苷酶活性最高，分別為1737、3179 IU/mL，比其他菌株至少分別高出5001%、2902%。濾紙酶活性最低的是F1菌株，為0616 IU/mL，同時其β-葡萄糖苷酶活性只有0394 IU/mL，這可能是在濾紙崩解試驗中該菌株對濾紙條的分解利用不如其他5個菌株的原因（圖2。關于纖維素酶水解天然纖維素的機制，目前普遍認為是由纖維素酶3種組分協(xié)同作用的結果。內切葡聚糖苷酶負責進攻纖維素的非結晶區(qū)，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶還原性末端或非還原性末端的小分子纖維素，外切葡聚糖苷酶從纖維素線狀分子的末端水解切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶最后將纖維二糖水解成葡萄糖[10]。雖然菌株G1內切葡聚糖苷酶活性較低（0628 IU/mL，生成小分子纖維素效率較慢，但是高活性的β-葡萄糖苷酶（1441 IU/mL可以快速將由外切葡聚糖苷酶水解產生的纖維二糖水解成葡萄糖，故G1的濾紙酶活性依然可以保持在較高的水平。

結合濾紙崩解試驗和酶活力測定試驗，認為G2是有相對較高纖維素酶活力的菌株，其濾紙酶、內切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分別為1737、3179、1232 IU/mL。

23高纖維素酶活力菌株G2的鑒定

菌株G2的顯微形態(tài)：菌體呈短桿狀，大小為（05～08 μm×（15～30 μm，染色均勻，具運動性，兼性厭氧，可形成內生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形， 芽孢著生點在菌體

[F（W10][TPLHF2tif][F]

中心，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽性（圖3。菌株G2在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產色素。

以菌株G2的全基因組DNA為模板，PCR擴增后經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條約15 kb的特異性條帶，經序[CM（25]列測定，長度為1 452 bp。將其與GenBank中報道菌株的[CM]

[F（W10][TPLHF3tif][F]

16S rDNA序列進行相似性分析表明，親緣關系相近的前20個序列都為芽孢桿菌屬（Bacillus的菌株，同源性均超過98%。運用MEGA50軟件中的鄰接法計算菌株G2的16S rDNA序列與同源性99%以上序列的進化關系，以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis作外群，經1 000次bootstrap驗證，獲得系統(tǒng)進化樹（圖4。[FL]

[F（W11][TPLHF4tif][F]

[FL（22]結合形態(tài)學與16S rDNA分子鑒定結果，初步確定G2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens。

3結論

國際上常用的除臭方法一般有化學法、物理法和生物法。生物除臭法中主要的作用因素是具有除臭功能的微生物，篩選高效除臭菌不僅可以提高惡臭物質的消化和降解速率，抑制惡臭菌的生長，同時也能夠有效分解垃圾中難降解的大分子有機物。國內對垃圾微生物除臭已有相關研究，如王光玉等利用微生物加速降解條件的初步研究[10]；汪英學等篩選可以降低垃圾填埋場氨氣和硫化氫氣體的微生物[11]；葉勁松等研究了垃圾中纖維素含量與纖維素降解菌之間的變化規(guī)律[12]。但是目前尚未篩選出同時具有除臭和產纖維素酶能力菌株的相關報道。本研究從貴州大學生命科學學院微生物實驗室提供的具有快速發(fā)酵和除臭功能的菌株中，通過濾紙崩解試驗篩選到6株具有一定產纖維素酶能力的菌株。通過在45 ℃、pH值85條件下測得各菌株的濾紙酶、內切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，挑選出纖維素酶活性最好的菌株G2。通過形態(tài)學和菌株16S rDNA擴增與分析，初步確定G2是解淀粉芽孢桿菌（B amyloliquefaciens。[JP+1]本試驗篩選出同時具有除臭及產纖維素酶能力的菌株，對有效利用分解城市垃圾中的纖維素和半纖維素、縮短垃圾發(fā)酵時間、增加垃圾發(fā)酵效率，以及為微生物除臭菌劑的制備提供菌種資源。

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