姜洪芳　石寶俊　張峰倫　趙伯濤　施國新　張衛(wèi)明

摘要：建立反相高效液相色譜，測定不同花色單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙莖、葉、花中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚含量。采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，乙腈-25%乙酸水為流動相，梯度洗脫進行分離，檢測波長245 nm。指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚在選定濃度范圍內線性關系良好，平均回收率分別為 1013%、9893%、10117%、10159%，RSD分別為0986%、196%、237%、127%，該方法簡單、快速、準確，可作為鳳仙花中萘醌類和黃酮類物質同時測定的方法。

關鍵詞：鳳仙花；萘醌；黃酮；高效液相色譜法

中圖分類號： O6577+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0344-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-18

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD36B01 。

作者簡介：姜洪芳（1974—，女，博士研究生，副研究員，從事天然產物活性物質應用與開發(fā)。E-mail：jhf74@163com。

通信作者：張衛(wèi)明，研究員，從事植物活性物質的應用與開發(fā)。E-mail：botanyzh@163com。

鳳仙花（Impatiens balsamina L為鳳仙花科（Balsaminaceae鳳仙花屬（Impatiens一年生草本植物。鳳仙花屬共有植物900余種，全球均有分布。鳳仙花作為觀賞植物在國內外均有種植，也是該屬植物的常見品種，其花、莖、葉、種子在民間有悠久的藥用歷史，被廣泛用于治療腰脅痛、 蛇咬傷、 鵝掌風、 風濕性關節(jié)炎、 癰癤瘡疔、 胎衣不下、 潰瘍日久不愈和經閉腹痛等，2010年版《中國藥典》收載其種子急性子作為藥用部位。鳳仙花的化學成分主要有黃酮、萘醌、香豆素、有機酸、花青素和甾醇類，其中黃酮和萘醌有很強的抗炎、抗菌、抗過敏和抑制Wnt信號通道等活性；據報道指甲花醌和2-甲氧基-1，4萘醌是該植物抗細菌和抗真菌的活性成分，2-甲氧基-1，4萘醌具有很強的對抗HepG2細胞的抗腫瘤活性[1-3]。國內外已有文獻報道，用高效液相色譜法（HPLC分別定量測定鳳仙花中的黃酮和萘醌類成分[4-7]，但對于2類成分含量的同時測定還未見報道，本研究應用HPLC對常見品種單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙在7月盛開期的莖、葉、花中指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山萘酚進行了測定，為該屬植物的開發(fā)應用提供技術依據。

1材料與方法

11材料

高效液相色譜儀Agilent 1200 HPLC（美國安捷倫公司生產，G1354A四元泵，G1313A自動脫氣機，G1316柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測器。

Q-600DE型超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產；

高效液相色譜（HPLC分析用甲醇、乙腈為色譜純（美國天地；試驗用水為超純水，提取用試劑均為分析純。

對照品包括指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚，均購于中國食品藥品檢定研究院，純度大于98%。單瓣鳳仙花及多重瓣茶鳳仙的莖、葉、花均于2012年7月采自南京，經南京野生植物研究院張玖教授鑒定為鳳仙花（Impatiens balsamina L。

12HPLC分析條件

Agilent Eclipse XDB-C18分離柱（46 mm×150 mm，5 μm；流動相為乙腈-25%醋酸水，梯度洗脫條件：0～10 min，25 ∶[G-3]75；10～20 min，32 ∶[G-3]68；20～35 min，25 ∶[G-3]75，流速10 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為25 ℃，DAD檢測器，檢測波長245、250、280、360 nm。

13對照品溶液的制備

分別稱取指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚對照品10 mg，精確稱定，甲醇溶解并定容，稀釋成濃度為50、40、25、125、10、625、312 μg/mL的溶液，經045 μm 微孔濾膜過濾，供HPLC測定，并繪制每種物質的標準曲線。

14供試品溶液的制備

稱取樣品粉末 （50 ℃ 烘干12 h，磨碎過40目篩 50 g，精確稱定，加入55% 乙醇水溶液80 mL，室溫浸泡2 h，超聲提取 1 h，定容至100 mL，濾液經045 μm 的微孔濾膜過濾，供HPLC測定。

2結果與分析

21標準品與樣品的HPLC測定

在“12”節(jié)色譜條件下，樣品中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚色譜峰的保留時間與對照品一致，4種成分的色譜峰均能得到較好的分離，樣品其他成分對欲測成分的測定無干擾（圖1。

22線性關系分析

將不同梯度濃度的混合對照品溶液分別進樣，進樣量為20 μL，以峰面積y為縱坐標，進樣質量濃度x （μg/mL為橫坐標繪制標準曲線，結果見表1。

23精密度試驗

準確吸取25 μg/mL指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚混合對照品溶液20 μL，按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測，重復測定3次，記錄保留時間和峰面積，計算各個化合物的相對標準差（RSD，均小于 15%（表2，表明儀器精密度良好。

24重復性試驗

精確稱取紅色鳳仙花葉子粉末5002 3 g，共5份，按照“22”節(jié)方法制備供試品溶液，再按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測，重復測定3次，記錄各化合物峰面積，計算得到各化合物含量的RSD為115 %～237%（表3，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

25穩(wěn)定性試驗

供試品溶液于配制后4、10、14、24 h分別進樣，記錄峰面

[F（W21][TPJHF1tif][F][FL]

[F（W9][HT6H][J]表1鳳仙花中不同化合物的線性方程[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W12，W16，W8，W16，W8W]化合物質量濃度（μg/mL保留時間（min線性方程相關系數

[BHDG12，W12Q3，W16DW，W8DW，W16Q4，W8W]指甲花醌325～520066y=9821x+83960997

[BHDW]槲皮素700～5600105y=4030x-258100997

2-甲氧基-1，4萘醌3625～58000121y=9436x-13340998

山奈酚3625～58000164y=5737x+31050994[HJ][BG）F][F）]

[FL（22]

[F（W8][HT6H][J]表2鳳仙花中不同化合物的保留時間和峰面積精密度[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W9，W20W]化合物[B（][BHDWG12，W10。2W]保留時間峰面積[XXSX2-SX92]均值（minRSD（%[XXSX2-SX92]均值RSD（%[BW]

[BHDG12，W9Q0，W5。4DWW]指甲花醌680452 986087

[BHDW]槲皮素1070621 238123

2-甲氧基-1，4萘醌1230662 784116

山奈酚1650831 610135[HJ][BGF]

注：n=3。[F]

積，結果峰面積RSD分別為指甲花醌135%、槲皮素236%、2-甲氧基-1、4萘醌253%、山奈酚236%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定。

26加標回收率

[CM（24]精確稱取已知含量的紅色鳳仙花的葉子3份，按照[CM]

[F（W9][HT6H][J]表3紅色鳳仙花葉子中不同化合物的含量[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W11，W9。2W]化合物含量均值（%RSD（%

[BHDG12，W11Q1，W9。2DWW]指甲花醌0204 8115

[BHDW]槲皮素0074 6187

2-甲氧基-1，4萘醌0078 3237

山奈酚0083 2216[HJ][BGF]

注：n=5。[F]

“22”節(jié)方法制備供試品溶液，分別加入50、25 、125 μg/mL指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚混合對照品溶液，按樣品測定項下方法進行操作，每個濃度每天測定3次，連續(xù)測定3 d，取其平均值，計算回收率（表4。

[FL]

[F（W8][HT6H][J]表4紅色鳳仙花葉子的回收率試驗結果[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W12，W36，W12W]化合物[B（][BHDWG12，W36W]回收率（%[BHDWG12，W12。3W][XXSX2-SX352]第1天第2天第3天RSD（%

[BHDG12，W12Q1，W12。4W]指甲花醌10021±13510213±12310156±11510130±099

[BHDW]槲皮素9673±1289958±1 5210048±2329893±196

2-甲氧基-1，4萘醌9857±10710173±16110321±09610117±237

山奈酚10026±18510172±218 10279±15610159±127[HJ][BGF]

注：n=3。[F]

[FL（22]27樣品測定

按照“22”節(jié)及“23”節(jié)的方法操作，測定不同鳳仙花樣品的指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚峰面積，按照“表1”中的標準方程計算出各種化合物的含量，結果見表5。

[FL]

[F（W10][HT6H][J]表5鳳仙花中萘醌及黃酮化合物含量[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W6，W54W]鳳仙花樣[B（][BHDWG12，W54W]化合物含量（%

[BHDWG12，W132。4W][XXSX2-SX532]指甲花醌2-甲氧基-1，4萘醌槲皮素山奈酚

[BHDWG12，W42。12W][XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花

[BHDG12，W6，W42。12DWW]白色020106900258 006100810836004601750133005303680714

[BHDW]紫色083202140321019400450258003101410131009601770653

紅色011702070236018200800626005500730158007400760603

粉紫色00710342030200040042063200870135002801020362

多重花瓣048400900337008400060135006100670100012801890765[HJ][BG）F][F）]

[FL（22]指甲花醌含量在鳳仙花的葉、花中較高，多數集中在02%～07% 之間，在紫色鳳仙花的莖中含量最高，為0832%，多重瓣茶鳳仙的莖中含量為0484%；2-甲氧基-1，4萘醌普遍分布在花中，以白色鳳仙花中為最高，達0836%；可見，萘醌類在植株中的總量以白色鳳仙花最高，為2127%，紫色鳳仙花位居第2 ，為1864%，多重瓣茶鳳仙最低，為1136%。槲皮素主要分布在葉和花中，以白色鳳仙花的葉子為最多，達0175%；山奈酚主要分布在各色鳳仙花的葉和花中，多重瓣茶鳳仙含量最高，達0765%，白色鳳仙花中為0714%；以槲皮素和山奈酚為代表的黃酮類物質在植株中的總量以白色鳳仙花最高，達1489%，多重瓣茶鳳仙花和紫色鳳仙花分別為1310%、1229%，粉紫色鳳仙花最低，為0714%。

3討論與結論

31提取溶劑的優(yōu)化

為了使供試品溶液獲得最佳的提取率，參照文獻 [4-7]，應用HPLC法比較水、55% 乙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯室溫下對紅色鳳仙花葉子浸泡提取的指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚的含量，以55% 乙醇溶液為溶劑能夠將4種物質最大量地提取出來。

32HPLC檢測波長的選擇

由于指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚的最大吸收波長不完全一致，如指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌最大吸收波長為250、280、350 nm，其中350 nm處的吸光度比較弱，槲皮素最大吸收波長為255、370 nm，山奈酚最大吸收波長為266、367 nm[5-7]，在HPLC分析中，DAD檢測器設置了245、250、280、360 nm多通道檢測模式，結果表明，4個化合物在245 nm處的峰面積均高于其他波長處的峰面積，所以選擇245 nm作為液相色譜分析的檢測波長，從而提高了檢測方法的靈敏度。

33HPLC流動相的確定

通過HPLC分析條件的篩選，有利于在最短的時間內將復雜組份完全分離，特別是有多個樣品需要分析時。用甲醇-水、乙腈-水對鳳仙花的葉子提取物進行分析，結果顯示乙腈-水分離效果優(yōu)于甲醇-水，縮短了分離時間，將25% 醋酸加入到水中，可以將欲分離的萘醌類物質與黃酮類物質達到基線分離，同時進行定量測定。

[JP2]從總體來看，白色鳳仙花的萘醌類和黃酮類物質含量較高，國外大量研究也是圍繞白色鳳仙花開展的，但紫色、粉紫色及多重瓣茶鳳仙中也含有較高的活性物質，可以作為藥用植物進行研究與應用。 生長環(huán)境、采收時間、種植資源等因素都會影響植物次生代謝產物的含量，可以利用能增加次生代謝產物的有利因素，進行組織培養(yǎng)，增加次生代謝產物的含量。

本試驗建立了HPLC同時測定鳳仙花中指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚含量的方法，該方法可同時測定萘醌、黃酮2類成分，可用于鳳仙花藥材的質量控制。

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