古麗米熱·阿布都熱依木　吳陽(yáng)升　林嘉鵬　汪立芹　張利　蔣香菊　楊楠　唐淑紅　黃俊成

摘要：利用RT-PCR方法，檢測(cè)不同直徑綿羊卵泡卵丘細(xì)胞中FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表達(dá)規(guī)律及卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明，大、中、小卵泡卵丘細(xì)胞中都有FSHR、EGFR、GHR、bFGF、CYP19A、AMH的mRNA表達(dá)，不同直徑卵泡卵丘細(xì)胞呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，大卵泡卵丘細(xì)胞與中小卵泡的卵丘細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量差異顯著（P<005；AMH在直徑>50 mm的卵泡卵丘細(xì)胞中有所下降。不同大小卵泡卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，結(jié)果表明，各卵泡卵母細(xì)胞直徑組間成熟率不顯著，隨卵泡直徑的增大卵裂率增加，10～20 mm組與21～50 mm組卵裂率都顯著低于>5 mm組 （P<005，相互間無(wú)差異（P>005；囊胚率也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，卵泡大于50 mm卵母細(xì)胞組極顯著高于10～20 mm組（P<001，21～50 mm組（P<005。證實(shí)卵丘細(xì)胞在綿羊卵母細(xì)胞成熟和受精及隨后的胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用，卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：綿羊；卵丘細(xì)胞；卵母細(xì)胞；RT-PCR

中圖分類號(hào)： S8263文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0236-04

準(zhǔn)確判斷卵母細(xì)胞的發(fā)育能力是提高各類輔助生殖成功的必要條件，從形態(tài)學(xué)上觀察卵母細(xì)胞的厚度及卵丘細(xì)胞包裹的緊密程度是評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的常用手段[1-2]，這種標(biāo)準(zhǔn)并不能真正預(yù)測(cè)胚胎的健康，需要從分子角度鑒定預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞的功能。卵丘細(xì)胞是指在卵母細(xì)胞外周并與之進(jìn)行代謝聯(lián)系的顆粒細(xì)胞群，對(duì)于卵母細(xì)胞成熟有極其重要的作用，主要表現(xiàn)在卵丘細(xì)胞參與維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯、誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)并支持卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟。卵丘細(xì)胞形態(tài)和卵丘細(xì)胞擴(kuò)展影響卵母細(xì)胞成熟的同時(shí)，卵母細(xì)胞對(duì)卵丘細(xì)胞的分化及發(fā)育也起著中心調(diào)節(jié)作用。Li等研究證明卵母細(xì)胞對(duì)卵丘細(xì)胞表型和生存有重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)卵丘細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、分化及細(xì)胞死亡、類固醇激素分泌有顯著影響[4-5]。最近，Ledda等提出，卵泡液和卵丘細(xì)胞可貯存及釋放某些生長(zhǎng)因子和某些特定蛋白質(zhì)，在卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育過(guò)程中按一定順序表達(dá)，或通過(guò)選擇性地?cái)U(kuò)散來(lái)調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育[6]。鑒于卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞雙邊通信的作用，可以推斷卵母細(xì)胞的發(fā)育能力變化很可能影響卵丘細(xì)胞的表型或者基因的表達(dá)，從而通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)來(lái)提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

本研究通過(guò)RT-PCR方法，檢測(cè)綿羊不同直徑卵泡卵丘細(xì)胞FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表達(dá)差異，以推斷這些基因?qū)β涯讣?xì)胞發(fā)育能力的影響，對(duì)預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力有著重要的意義。RT-PCR方法克服了通過(guò)表觀參數(shù)而選擇卵母細(xì)胞的不可靠性，是一個(gè)非侵入性辨別卵母細(xì)胞質(zhì)量的新方法。

1材料與方法

11材料

111藥品及試劑RNeasy Micro RNA提取試劑盒、QIAEX II 瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均購(gòu)于QIAGEN；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA LA-PCR（AMV、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq、Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體，均購(gòu)于大連寶生物公司；培養(yǎng)用胎牛血清 （FBS、非必需氨基酸（NEAA，均購(gòu)自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，購(gòu)自Bovogen公司。

112綿羊卵泡采集綿羊卵巢來(lái)源于新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)。將采集的卵巢放入37 ℃、含有09%生理鹽水的保溫瓶中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；用生理鹽水將成年綿羊卵巢洗滌3～4次，置于燒杯內(nèi)，用注射器抽吸直徑為10～20 mm、21～50 mm和>50 mm的卵泡，收集于盛有抽卵液的90 mm培養(yǎng)皿中。

12方法

121卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)將成年綿羊GV期卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs按不同直徑移入預(yù)先平衡好的成熟液中，在386 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行成熟培養(yǎng)，以卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞擴(kuò)展程度并排出第一極體作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)。

122卵丘細(xì)胞的分離在體視鏡下，選取形態(tài)完好的COCs放入01%透明質(zhì)酸酶中，用玻璃管在成熟培養(yǎng)液中反復(fù)吹打機(jī)械分離卵丘細(xì)胞；將含有卵丘細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液，收集在裝有15 mL PBS的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次；將卵丘細(xì)胞轉(zhuǎn)入裂解液中，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中，待RT-PCR檢測(cè)分析。

123卵母細(xì)胞孤雌激活挑選有極體且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，在含5 μmol/L離子霉素（ionomycin的激活液中激活4 min；經(jīng)2 mmol/L 6-DMAP培養(yǎng)液洗2次，移入含 6-DMAP 的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)2 h；培養(yǎng)液洗滌3次，移入含有600～700 μL體外培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板中，CO2箱培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)卵裂率，統(tǒng)計(jì)6～8 d囊胚率。CO2箱培養(yǎng)條件為 386 ℃、5% CO2、5% O2、90%N2及飽和濕度。

124RNA提取與cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成根據(jù)QIAGEN RNeasy Micro it操作步驟提取總RNA，溶解于14 μL RNase-free水，按照大連寶生生物公司（TaaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：RNA 1 μL，隨機(jī)引物（表11 μL，加RNAse-free水至 15 μL；置于PCR儀中75 ℃ 10 min，4 ℃ 暫停取出；立即冰浴2 min，加入Inhibitor 05 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、dNTP mixture（each 25 mmol/L 75 μL、M-MLV酶 1 μL，42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。endprint