楊偉群， 管月清

(臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州318000)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，因其效高價(jià)廉，曾廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也曾被大量使用［1］。但研究結(jié)果證實(shí)，氯霉素對(duì)機(jī)體有很大的毒副作用［2］，會(huì)引起動(dòng)物體內(nèi)正常菌群失調(diào)，同時(shí)可能引起機(jī)體的再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥等疾病。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)都有嚴(yán)格規(guī)定［2］，中國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002 年公布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》也規(guī)定氯霉素被禁止用于食品動(dòng)物［3］。因此，建立氯霉素殘留的ELISA 快速定量檢測(cè)方法，對(duì)于畜產(chǎn)品的安全控制具有重要意義。

常用氯霉素殘留檢測(cè)方法主要有儀器分析法、免疫化學(xué)法和微生物法［4-6］。儀器分析法中氣相色譜法和液相色譜法具有精密度較高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)［7-8］，但存在前處理過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，儀器操作較為繁瑣等缺點(diǎn)，不適合用于大規(guī)模的樣品分析檢驗(yàn)。免疫化學(xué)法具有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行篩檢的特點(diǎn)［9-10］，其中高特異性抗體的制備，是提高免疫檢測(cè)方法靈敏度的基礎(chǔ)。本研究擬采用重氮化法制備出氯霉素完全抗原，獲得氯霉素高特異性多克隆抗體，為建立氯霉素膠體金試紙或ELISA 試劑盒等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)雄性大耳白兔6 只(體質(zhì)量為2. 5 ～3. 0kg)購(gòu)自試驗(yàn)動(dòng)物中心;免疫原:氯霉素-BSA、氯霉素-OVA(均為實(shí)驗(yàn)室制備)［10-11］;弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma 公司;HiTrapTMProtein G 親和層析純化柱(5 ml)購(gòu)自GE Healthcare(美國(guó));酶標(biāo)儀(型號(hào):Thermo MK3);低速離心機(jī)(型號(hào):LD5-2A)。

1.2 完全抗原制備與動(dòng)物免疫

1.2.1 完全抗原的合成 以琥珀氯霉素作為半抗原，利用重氮化法將半抗原與載體蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)［11-12］。具體方法為:稱取0. 20 mmol氯霉素半抗原完全溶于0. 4 ml 無(wú)水乙醇中，用0. 5 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至1. 0，加入0. 45 mmol的鋅粉于85 ℃反應(yīng)35 min。離心取上清液，并用1. 0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1. 0，于4 ℃邊攪拌邊緩慢滴加NaNO2溶液(0. 1 mol/L)至淀粉碘化鉀試紙變灰藍(lán)。然后選用氫氧化鈉溶液(1. 0 mol/L)將反應(yīng)液pH 調(diào)至8. 0，于4 ℃避光條件下反應(yīng)2 h，離心取上清液即氯霉素重氮鹽溶液。取適量BSA 或OVA 溶解于2 ml 0. 02 mol/L的PBS 中，滴加NaOH 保持溶液pH 為7. 0。偶聯(lián)物離心去除沉淀后于4 ℃避光攪拌12 h，用0. 01 mol/L pH7. 4 的PBS 充分透析。

1.2.2 免疫原乳化處理［12］于滅菌生理鹽水中準(zhǔn)確配置2 mg/ml CAP-BSA 免疫原溶液，吸取2 ml 免疫原溶液放入Eppendorf 管中并加入等量弗氏佐劑。采用一次性注射器緩慢反復(fù)均勻抽吸，使抗原充分乳化。

1.2.3 動(dòng)物免疫 剪去背毛，酒精消毒后進(jìn)行背部皮下5 點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射約0.2 ml，每只兔總注射量為1 ml。首次免疫1 個(gè)月后，進(jìn)行第2 次加強(qiáng)免疫，此后每隔2 周加強(qiáng)免疫1 次，每次免疫前耳緣靜脈取血ELISA 法測(cè)定血清效價(jià)。當(dāng)效價(jià)滿足要求，即可在第3 ～5 d 進(jìn)行采血。

1.3 氯霉素多克隆抗體純化［8］

利用HiTrapTMProtein G 親和層析純化柱進(jìn)行抗血清純化，方法為:按每管收集1 ml 樣品添加60 ～200 Ul 1 mol/L的Tris-HCl 溶液(pH 為9.0)，添加到樣品收集管中備用，用10 倍柱床體積的上樣緩沖液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 為7.0)洗滌純化柱后，用注射器上樣，上樣完畢后用5 ～10 倍柱床體積的上樣緩沖液洗滌，然后用3 倍柱床體積的洗脫液(0.1 mol/L Gly-HCl，pH 為2.7)洗脫，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定，PBS 4 ℃透析脫鹽48 h。

1.4 抗血清特異性鑒定

1.4.1 抗血清效價(jià)測(cè)定 應(yīng)用間接ELISA 方法測(cè)定純化后抗血清的效價(jià)。以氯霉素-OVA 為包被原，每孔2 μg(100 ml)，冰箱4 ℃包被過(guò)夜，3%OVA 封閉后，加入系列稀釋的抗血清，37 ℃孵育2 h后洗滌，加入羊抗兔IgG (1∶ 3 000稀釋)，孵育1 h后洗滌，加入底物顯色液每孔90 μl，37 ℃溫箱暗處放置10 min，2 mol/L的濃硫酸終止反應(yīng)，于450 nm處檢測(cè)吸光度值，以陽(yáng)性O(shè)D 值:陰性O(shè)D 值＞3 的最高稀釋倍數(shù)定為抗血清效價(jià)。

1.4.2 抗血清競(jìng)爭(zhēng)活性分析 應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法測(cè)定純化后抗血清的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。以氯霉素-OVA 為包被原，每孔2 μg(100 ml)，冰箱4℃包被過(guò)夜，3% OVA 封閉后，加入抗血清(1∶5 000稀釋)和系列稀釋的游離氯霉素抗原，37 ℃孵育2 h 后洗滌，加入羊抗兔IgG (1∶ 3 000稀釋)，孵育1h 后洗滌，加入底物顯色液每孔90 μl，37 ℃溫箱暗處放置10 min，2 mol/L的濃硫酸終止反應(yīng)，于450 nm 處檢測(cè)吸光度值，根據(jù)抑制率(抑制率=系列稀釋的氯霉素A450/氯霉素為0 的A450)對(duì)氯霉素濃度繪制競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線圖計(jì)算IC50。

1.4.3 抗血清特異性分析 應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定純化后抗血清的特異性。方法同競(jìng)爭(zhēng)活性分析，不同的是以氯霉素結(jié)構(gòu)功能類似物(包括鏈霉素、青霉素和四環(huán)素)代替氯霉素作為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，計(jì)算IC50，根據(jù)公式:交叉反應(yīng)率(CR)=待測(cè)物的IC50/交叉反應(yīng)物的IC50×100%，計(jì)算交叉反應(yīng)率，評(píng)價(jià)抗血清的特異性［8］。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原鑒定

采用紫外吸收法鑒定完全抗原，結(jié)果如圖1 所示，從圖1 可以看出半抗原(Hap)、載體蛋白(BSA、HAS、OVA)和完全抗原(Hap-OVA、Hap-BSA)的紫外吸收曲線存在很大不同，完全抗原的吸收峰出現(xiàn)明顯飄移，其消光系數(shù)均大于半抗原及載體蛋白，間接說(shuō)明CAP-BSA 偶聯(lián)成功。根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算出其結(jié)合比依次約為:CAP∶ OVA =1.5∶ 1.0，CAP∶ BSA=7∶ 1。

圖1 完全抗原Hap-OVA、Hap-BSA 的紫外鑒定圖Fig.1 The UV spectrum of complete antigen Hap-OVA and Hap-BSA

2.2 抗血清純化

如圖2 所示，抗血清純化前有明顯的電泳雜帶，說(shuō)明除氯霉素抗體外還有其他雜蛋白，而經(jīng)過(guò)親和層析純化柱(HiTrapTMProtein G)進(jìn)行蛋白純化處理后，其電泳雜帶則明顯減少。顯示雜蛋白被基本去除，所得抗體純度較高，可以應(yīng)用于下一步試驗(yàn)。

圖2 氯霉素抗體純化SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.2 The identification of polyantibody by SDS-PAGE

2.3 抗體效價(jià)間接ELISA 測(cè)定

用Hap-BSA 偶聯(lián)物免疫家兔，背部皮下多點(diǎn)注射。從第1 次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫1 周后在前耳緣靜脈取血1. 5 ml 分離血清，采用間接ELISA［13］測(cè)定抗血清效價(jià)。當(dāng)效價(jià)達(dá)到1∶ 10 000以上時(shí)，按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法測(cè)定其競(jìng)爭(zhēng)性，從而得到所制人工抗體的檢測(cè)靈敏度和抗體特異性。ELISA 測(cè)試結(jié)果如圖3 所示，在第4 次加強(qiáng)免疫后血清效價(jià)迅速上升，第5 次、第6 次加強(qiáng)免疫后，血清效價(jià)維持在1∶ 8.0 ×105到1∶ 1.0 ×106水平，具有該效價(jià)的血清可以用于下一步的檢測(cè)試驗(yàn)。

3.4 抗血清競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)氯霉素

氯霉素-OVA 稀釋2 000倍后包被酶標(biāo)板，采用0.1% OVA 封閉。用10%甲醇溶解氯霉素，進(jìn)行10倍梯度稀釋為1 000 mg/ml至1 ng/ml溶液，加樣完畢后再加入10 000倍稀釋的抗血清，37 ℃孵育1.5 h，甩去酶標(biāo)孔中液體，PBS 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育45 min，PBS 洗滌4 次后，加入100 μl 的TMB 底物液，避光顯色5 ～7 min 后加入2 mol/L硫酸終止液后于450 nm 處測(cè)定吸光度值，以氯霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其結(jié)果如圖4 所示。線性回歸方程:y = 43.44 lgC + 0.689 9，R2= 0.986 5，由此計(jì)算IC50=13.65 ng/ml，最低檢測(cè)限1.01 ng/ml，檢測(cè)范圍為1.26 ～113.75 ng/ml。

圖3 6 次免疫的血清效價(jià)的變化Fig.3 Variation of serum titers after six immunizations

圖4 ELISA 法測(cè)定氯霉素的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線Fig.4 Competitive binding curves of CAP by ELISA

3.5 氯霉素抗血清的特異性分析

加入結(jié)構(gòu)功能類似物鏈霉素、青霉素和四環(huán)素作為交叉反應(yīng)物，按照公式計(jì)算交叉反應(yīng)率(表1)，氯霉素抗血清與其他類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)，特異性好。

表1 氯霉素抗血清與其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率Table 1 The cross reaction of chloramphenicol antiserum with its structural analogs

3 結(jié)論

本研究以琥珀氯霉素作為半抗原，利用重氮化法將半抗原與載體蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)紫外分光光度法鑒定，成功制備了完全抗原Hap-BSA 和Hap-OVA。以Hap-BSA 為免疫原多次免疫家兔后，經(jīng)ELISA 法測(cè)定，抗體效價(jià)可穩(wěn)定維持在1∶ 8.0 ×105到1∶ 1.0 ×106之間，獲得了氯霉素高滴度抗體，以Protein G 親和層析純化柱純化氯霉素抗血清，SDSPAGE 分析結(jié)果表明獲得了抗血清純化制品，該抗血清與氯霉素結(jié)構(gòu)功能類似物青霉素、四環(huán)素和鏈霉素均無(wú)明顯交叉反應(yīng)，其檢出限達(dá)到1.01 ng/ml。本研究成功獲得了靈敏度高、特異性好的氯霉素抗血清，為建立動(dòng)物性食品中氯霉素殘留快速免疫檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

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