蘇 芃， Nguyen Hac Hien， 管 葦， 崔 利， 陳勁楓

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210095)

黃瓜(Cucumis sativus L.)屬于葫蘆科黃瓜屬，是一種重要的世界性蔬菜作物［1-4］。黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，種內(nèi)變異率僅為3% ～8%，加上長(zhǎng)期的定向選擇和大量雜種F1代的廣泛應(yīng)用，使得多數(shù)地方品種資源趨于絕跡，導(dǎo)致現(xiàn)代黃瓜育種面臨著資源危機(jī)［5-7］。目前簡(jiǎn)單的常規(guī)育種手段已不能滿足黃瓜新品種的選育及抗病育種的需求，單倍體培養(yǎng)被育種家認(rèn)為是縮短育種周期、提高選擇效率、獲得遺傳材料和有用突變體的一個(gè)重要途徑［8］。通過(guò)單倍體誘導(dǎo)技術(shù)可以快速獲得純系(單倍體和雙單倍體)，進(jìn)而可以加快黃瓜的育種進(jìn)程。

輻射花粉授粉結(jié)合胚拯救技術(shù)是一種獲得黃瓜單倍體的重要手段，Sauton［9］首次采用輻射花粉授粉結(jié)合胚拯救技術(shù)獲得甜瓜單倍體。在黃瓜上，也有研究報(bào)道通過(guò)輻射花粉誘導(dǎo)單倍體成功。

本試驗(yàn)系統(tǒng)的研究了輻射劑量、花粉供體基因型、母本基因型對(duì)誘導(dǎo)黃瓜單倍體植株再生率的影響，旨在摸索出一套高效的輻射花粉授粉誘導(dǎo)黃瓜單倍體的技術(shù)體系，為黃瓜種質(zhì)創(chuàng)新提供一個(gè)可靠的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用黃瓜材料來(lái)源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院。母本基因型:南抗1 號(hào)(F1)、津綠(F1)、博美(F1)、EC1(自交系)、5211(自交系)、CC3(自交系)、11535F(Poinsett97 ×CC3 G)、11514F(PO2 G×Beit Anpha)、11536F(Poinsett97 × PO2 G)、11568(EC1 ×津綠G)、12211S(長(zhǎng)春密刺×10406S-93)、12331S(NC-76 × 二早子)、12523S(PO2 × 平望黃瓜)、12524S(PO2 ×SWCC8)、12548S(PO2 ×Marketmore 2000(401))、12549S(PO2 ×7011A)、12551S(PO2 × Poinset 97)、12552S(PO2 × L8)、12553S(PO2 × 白 玉)、12361S (PO2 G × Poinsett 97)、12359S(627 G ×P01)。試驗(yàn)地點(diǎn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實(shí)驗(yàn)基地，花粉供體基因型:5211(自交系)、CC3(自交系)和南抗一號(hào)(F1)。

輻射源:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻射中心60Coγ 源。輻射劑量為:150 Gy、250 Gy、350 Gy，劑量率為2.62 Gy/min?；九囵B(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉，pH 值為5.8。繼代培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉+0.2 mg/L 6-BA，pH 值為5.8。生根培養(yǎng)基:1/2MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉+0.2m g/L 6-BA，pH 值為5.8。

1.2 方法

1.2.1 花粉輻射與授粉 在開花前1 d 采集黃瓜花粉供體材料的雄花，裝入防水袋，在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行60 Coγ 射線輻射(輻射劑量梯度為150 Gy、250 Gy、350 Gy)處理后，將雄花放在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中常溫保存。當(dāng)天下午選擇第2 d 開花的雌花進(jìn)行夾花隔離。第2 d上午用輻射過(guò)的雄花進(jìn)行授粉，每3 朵雄花授1朵雌花，授粉后的雌花套袋隔離至坐果。第1 d采集5211 的雄花進(jìn)行150 Gy 輻射劑量輻射，第2 d 用輻射處理過(guò)的雄花對(duì)當(dāng)天開花的雌花做授粉處理。

1.2.2 胚胎拯救及幼苗培養(yǎng) 授粉2 ～3 周后采收果實(shí)，在超凈工作臺(tái)上，用75%的乙醇對(duì)果實(shí)表面消毒，將果實(shí)刨開分離種子接種到不添加任何激素的MS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行胚拯救培養(yǎng)，待胚長(zhǎng)至肉眼可見時(shí)剝?nèi)シN皮進(jìn)一步培養(yǎng)。隨后，對(duì)部分黃綠色的小胚接種于繼代培養(yǎng)基上直接成苗培養(yǎng)。

1.2.3 馴化移栽 當(dāng)胚長(zhǎng)成小植株后將其轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)12 d 后，將再生植株煉苗3 d后移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。

1.2.4 再生植株倍性鑒定 待植株長(zhǎng)成后，進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)［10］，確認(rèn)植株倍性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)不同基因型和不同輻射劑量下黃瓜植株再生誘導(dǎo)率。植株再生率=植株再生數(shù)/種子數(shù)×100%單倍體再生率=單倍體植株數(shù)/種子數(shù)×100%二倍體再生率=二倍體植株數(shù)/種子數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉供體基因型對(duì)單倍體誘導(dǎo)率的影響

2.1.1 花粉供體基因型對(duì)植株再生率影響 花粉經(jīng)150 Gy 劑量下輻射處理時(shí)，花粉供體為5211 時(shí)植株再生率最高，為3.92%，顯著高于 CC3(0.42%)及南抗一號(hào)(0.32%)作為花粉供體時(shí)的再生率，表明花粉供體基因型對(duì)植株再生率有影響;在輻射劑量250 Gy 輻射處理花粉時(shí)，基因型對(duì)植株再生率也有影響;但是在使用350 Gy 輻射劑量輻射處理花粉時(shí)，植株再生率都較低(表1)。

2.1.2 花粉供體基因型對(duì)單倍體誘導(dǎo)率影響 不同花粉供體基因型對(duì)單倍體植株誘導(dǎo)率的影響顯著(P ＜0.05)。5211 經(jīng)150 Gy 劑量輻射處理的單倍體植株誘導(dǎo)率最高，為1.96%，顯著高于150 Gy 劑量處理下CC3(0.21%)及南抗一號(hào)(0.19%)的單倍體植株誘導(dǎo)率，南抗一號(hào)單倍體植株誘導(dǎo)率最低。5211 經(jīng)250 Gy 劑量輻射處理誘導(dǎo)單倍體植株再生率也最高(1.64%)，而CC3 在250 Gy 劑量處理下單倍體植株誘導(dǎo)率最低(0.11%)。以上研究結(jié)果都不同于G. Caglar、Ficcadenti［11-12］，他們的研究結(jié)果表明相同輻射劑量處理?xiàng)l件下花粉供體的基因型對(duì)單倍體誘導(dǎo)率沒(méi)有影響。

表1 不同花粉供體基因型及輻射劑量對(duì)植株再生率的影響Table 1 Effect of different genotypes and gamma ray doses on the rate of plants regeneration

2.1.3 花粉供體基因型對(duì)二倍體再生率影響 經(jīng)150 Gy 輻射處理后再生后代中仍有二倍體出現(xiàn)，其比例為5211(1.96%)＞CC3(0.21%)＞南抗一號(hào)(0.13%)。

以上結(jié)果表明150 Gy 輻射劑量條件下植株再生率和單倍體再生率5211 ＞CC3 ＞南抗一號(hào)，說(shuō)明使用5211 作為花粉供體輻射后授粉誘導(dǎo)較易獲得單倍體，而南抗一號(hào)較難作為花粉供體用于獲得單倍體。此外隨著植株再生率的增加，單倍體植株再生率也增加。

2.2 輻射劑量對(duì)植株再生率的影響

對(duì)相同基因型不同輻射劑量處理誘導(dǎo)的植株再生率比較分析，結(jié)果表明，150 Gy 輻射劑量處理下總體上植株再生率高于250 Gy 及350 Gy 輻射劑量處理下的植株再生率。

2.3 母本基因型對(duì)單倍體誘導(dǎo)率的影響

從表2 看出，供體花粉輻射劑量為150 Gy、花粉供體基因型為5211 時(shí)，不同母本基因型單倍體的誘導(dǎo)率存在很大差異，其中6 個(gè)基因型沒(méi)有誘導(dǎo)出再生植株，占基因型總量的60%，其他基因型單倍體誘導(dǎo)率為0.26 ～0.54。

3 討論

在甜瓜中不同正反交組合單倍體植株的再生率有顯著差異［12］;黃瓜上，有研究結(jié)果表明親本的基因型對(duì)單倍體再生率沒(méi)有影響［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，親本基因型對(duì)植株再生率影響顯著。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)150 Gy 輻射劑量下，不同花粉供體植株再生率為5211 ＞CC3 ＞南抗一號(hào)，說(shuō)明5211 作為輻射花粉供體誘導(dǎo)較易獲得單倍體，而南抗一號(hào)作為花粉供體較難獲得單倍體。由于試驗(yàn)場(chǎng)地有限，所以每株留瓜3 ～4個(gè)，比常規(guī)多留1 ～2 個(gè)種瓜，且越晚授粉的種瓜由于營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致發(fā)育良好的種子數(shù)較少，從而導(dǎo)致單倍體再生率較低，本研究得到的單倍體植株再生率最高為1.96%。

表2 母本基因型對(duì)單倍體誘導(dǎo)率的影響Table 2 The effects of genotype on haploid induction efficiency

本試驗(yàn)對(duì)10 個(gè)母本基因型黃瓜誘導(dǎo)研究中，6個(gè)基因型沒(méi)有誘導(dǎo)出再生植株，占基因型總量的60%;4 個(gè)基因型誘導(dǎo)出再生植株，占基因型總量的40%，單倍體誘導(dǎo)率為0.26 ～0.54，說(shuō)明不同母本基因型單倍體的誘導(dǎo)率存在較大的差異。

研究認(rèn)為60Coγ 射線輻射花粉授粉是誘導(dǎo)葫蘆科作物產(chǎn)生單倍體的有效輻射源［13］。輻射劑量的選擇是誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的關(guān)鍵因素之一。有研究結(jié)果表明，合適的輻射劑量選擇和植物的倍性及花粉粒的大小有關(guān)，倍性越高或花粉粒越小越耐輻射［14-15］。黃瓜、西瓜常用的推薦輻射劑量為200 ～300 Gy［11，16］。但 是Ficcadenti［12］在 黃 瓜 上 采 用100 ～300 Gy 劑量，結(jié)果表明150 Gy 單倍體再生率最高。本研究結(jié)果也證實(shí)了150 Gy 為最佳輻射劑量。

［1］ 吳傳萬(wàn)，杜小鳳，顧大路，等. 植物源藥肥對(duì)溫室黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育和土壤環(huán)境的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30(1):92-99.

［2］ 張黎杰，周玲玲，李志強(qiáng)，等.菌渣復(fù)合基質(zhì)栽培對(duì)目光溫室黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(3):109-111.

［3］ 費(fèi)雨蘭，王 晶，沈 佳，等.不同砧木嫁接對(duì)黃瓜長(zhǎng)勢(shì)及果實(shí)品質(zhì)的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(12):147-149.

［4］ 劉 琴，王 艷，徐 健，等. 枯草芽孢桿菌Bs-1013 的抑菌活性及其包衣對(duì)黃瓜發(fā)芽生長(zhǎng)的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(11):117-119.

［5］ KENNARD W C，POTTER K，DIJKHUIZEN A，et al. Linkages among RFLP，RAPD，isozyme，disease resistance，and morphological markers in narrow and wide crosses of cucurnber［J］. Theoretical and Applied Genetics，1994，89:42-48.

［6］ BRADENN J M，STAUB J E，WYE C，et al. Towards an expanded and integrated linkage map of cucumber (Cucumis sativus L.)［J］.Genome，2001，44:111-119.

［7］ 李加旺，張文珠，何忠魁. 黃瓜資源篩選與育種研究及其發(fā)展趨勢(shì)［J］. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，5(4):36-38.

［8］ 張獻(xiàn)龍. 植物生物技術(shù)［M］. 北京:科學(xué)出版社，2004:35-69.

［9］ SAUTON. A，DUMAS DE VAULX R. Obtention de plantes hapl?ids chezle melon (Cucumis melon L.)aprèsgynogènèse induite pardu pollen irradiè［J］. Agronomie，1987，7:141-148.

［10］ 陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物卷須制片鑒定染色體數(shù)目的研究［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29(4):378-380.

［11］ CAGLAR. G，ABAK K. Progress in the production of haploid embryos，plants and doubled haploids in cucumber (Cucumis sativus L.)by gamma irradiated pollen in Turkey［J］. Acta Horticulturae，1999，492:317-320.

［12］ FICCADENTI N，VERONESEP，SESTILIS，et al. Influece of genotype on the inductuin of haploidy in Cucumis melo L. by using irradiated pollen［J］.J Genet＆Breed，1995，49:359-364.

［13］ FARIS N M. The effectof gamma irradiation dose on cucumber(Cucumis sativus L.)haploid embryo production［J］. Acta Physiologiae Plantarum，1999，21(4):391-396.

［14］ VISSER T，OSST E H. Pollen and pollination experminentsIII the viability of apple and pear pollen as affected by irradiation and storage［J］. Euphytuca，1981. 30:65-70.

［15］ DENISSEN，CJM DENIJS A P M. Effects of gamma irradiation on in vitro pollen germination of different Cucumis species［J］. Euphytica，1987，36:651-658.

［16］ SARI N AK. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon［J］. Hortscience，1994，29(10):1189-1190.