盧松茂， 陳振東， 林秀香， 鄭少緣， 余智城

(福建省熱帶作物科學(xué)研究所，福建 漳州363001)

蘆筍(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏，素有“蔬菜之王”的美稱，富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素及人體所需的微量元素等［1］。中國已成為世界上生產(chǎn)和出口蘆筍數(shù)量最大的國家［2］。蘆筍莖枯病(Asparagus stem blight)是蘆筍的一種毀滅性病害，其病原菌最初由Saccardo［3］命名為天門冬莖點霉(Phoma asparagi)，而后Bubak［4］將其更正為天門冬擬莖點霉(Phomopsis asparagi)，并一直沿用到現(xiàn)在。當(dāng)前，P. asparagi 在國內(nèi)外的蘆筍產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生危害，國內(nèi)主要分布在福建、山東、海南、山西、河南、臺灣等省［5-7］，國外主要分布在美國、歐洲、澳大利亞、意大利、新西蘭、希臘等國家［8-10］。在發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)發(fā)病率達100%［11-12］，病情指數(shù)達50 ～70［13］，導(dǎo)致蘆筍植株整株干枯，嚴(yán)重影響蘆筍的品質(zhì)和產(chǎn)量。

核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列是介于18S rDNA、5.8S rDNA 和28S rDNA 之間的區(qū)域，該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，在種內(nèi)不同菌株間高度保守，而在真菌的種間存在著豐富的變化［14-15］。rDNA-ITS 序列測定和比對為大量生物的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系的鑒定提供了有價值的參考，己被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系較近分類群的系統(tǒng)發(fā)育研究［16］。Murali 等［17］利用rDNA-ITS 序列分析結(jié)果表明寄生在柚木上的內(nèi)生菌Phomopsis 存在多個不同的組群。Kanematsu 等［18］從形態(tài)特征觀察和ITS 序列分析認(rèn)為寄生在薔薇科果樹上的Phomopsis 與P.asparagi 在分子系統(tǒng)發(fā)育上存在差異。目前，尚未見基于rDNA-ITS 序列對P. asparagi 與寄生在其他蔬菜、果樹和經(jīng)濟林木上的Phomopsis 菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析的研究報道。本研究對分離自福建漳州不同地區(qū)的3 個P. asparagi 菌株的ITS 序列進行測定，并對P. asparagi 菌株與GenBank 中登錄的寄生在其他蔬菜、果樹和經(jīng)濟林木上的19 個種的擬莖點霉菌株的ITS 序列(共35 條)進行多序列比對分析，以進一步揭示P. asparagi 與擬莖點霉屬其他重要種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為P. asparagi 的分子鑒定及其分子進化關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2010 ～2013 年，在福建省東山縣蘆筍產(chǎn)區(qū)和福建省熱帶作物科學(xué)研究所內(nèi)蘆筍試驗地采集具有蘆筍莖枯病典型癥狀的莖稈組織，采用常規(guī)組織分離法［19］對病斑上的病菌進行分離和純化，并參照盧松茂等［20］方法進行形態(tài)特征鑒定和致病性測定，獲得3 個Phomopsis asparagi 菌株(PDL、PQW、PWF)，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃、12 h 光暗交替條件下用燕麥培養(yǎng)基(OA)培養(yǎng)7 d，備用。

1.2 菌絲體的收集及基因組DNA 的提取

將已在燕麥培養(yǎng)基(OA)上25 ℃條件下生長7 d 的3 個Phomopsis asparagi 菌株(PDL、PQW、PWF)菌落邊緣分別切取直徑為5 mm 的菌餅，接種至裝有100 ml 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)的三角瓶上，每瓶接3 塊菌餅，在25 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。用紗布過濾菌液，獲得菌絲置于無菌的濾紙上吸去水分，55 ℃下烘30 min。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)法提取基因組DNA［21］。

1.3 PCR 擴增及測序

利用真菌ITS 通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和下游引物ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴增病菌rDNA-ITS 序列。PCR 反應(yīng)體系組成成分為:10 × Buffer(含MgCl2)2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μl，ITS1 和ITS4(10 μmol/L)各1.5 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 17.8 μl。PCR 反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶清晰的PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工雙向測序。

1.4 供試菌株ITS 序列分析

將供試菌株P(guān)DL、PQW、PWF 的ITS 序列分別與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST 分析，比較同源性。用Clustal X、SeqMan 等軟件分析供試菌株P(guān)DL、PQW、PWF 與已發(fā)表的P. asparagi 菌株(GenBank 登錄號:JQ070363)的核糖體DNA-ITS序列差異，分析其5.8S 及其側(cè)翼的ITS 區(qū)的變異情況。

1.5 基于ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將供試菌株(PDL、PQW、PWF)及來自GenBank登錄的寄生在其他蔬菜、果樹、經(jīng)濟林木等上的35個擬莖點霉菌株(表1)的ITS 序列用Clustal X 軟件進行多序列比對分析，并用MEGA5.0 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 檢驗1 000次。

表1 35 個擬莖點霉菌株及來源Table 1 35 Phomopsis strains and their sources

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株核糖體ITS 序列分析

分別以提取的PDL、PQW 和PWF 菌株基因組DNA 為模板，用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳后均得到大小約為600 bp 的DNA 片段(圖1)。上海生工雙向測序結(jié)果顯示，PDL、PQW 和PWF 菌株的片段大小與預(yù)測的較為一致，它們的ITS 序列長度分別為585 bp、585 bp、587 bp。將PDL、PQW 和PWF 菌株的ITS 序列提交至NCBI 后，獲取登錄號分別為KJ801804、KJ801805、KJ801806。三者的ITS1-5.8S-ITS2 序列的一致性達100%，其中rDNA-ITS1 全長為173 bp，5.8S 全長為159 bp，rDNA-ITS2 全長為160 bp。它們與P. asparagi 菌株P(guān)a1100(GenBank 登錄號:JQ070363)ITS1-5.8S-ITS2 序列的同源性達99. 8%，僅在rDNA-ITS2 有1 個堿基的差異，由堿基A→G 單堿基轉(zhuǎn)換。由此說明P. asparagi 同種內(nèi)的不同個體之間的ITS 序列是非常保守的。

2.2 基于ITS 序列的擬莖點霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 3 株P(guān). asparagi 菌株的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of three strains of P. asparagi

將35 個擬莖點霉菌株的ITS 序列進行多序列比對分析，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖2)顯示，35 個菌株被劃分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組群，且除Diaporthe sojae、Phomopsis longicolla、P. mali 和P. castaneae 外，同一組群的不同種分別聚在不同的分支上，表明寄生在蔬菜、水果和經(jīng)濟林木等植物上的擬莖點霉之間的ITS 序列存在一定差異。其中，P. asparagi與寄生葡萄的P. viticola、馬尾松的P. phyllanthicola、楊桃的P. averrhoae、芒果的Diaporthe phaseolorum 等菌株聚在I 組群的A 亞群，它們之間的ITS 序列差異小，表明它們之間的親緣關(guān)系近，但又存在一定分化;Ⅰ組群B 亞群的擬莖點霉(P. ternstroemia、P. azadirachtae、P.mali、P. castaneae、P. perniciosa、P. fukushii)及C 亞群的擬莖點霉(P. longanae)與P. asparagi 的親緣關(guān)系次之;寄生在葫蘆、黃瓜、野生大豆、大豆、茄子和柑橘等植物上的擬莖點霉分別聚在Ⅱ組群的A 和B 亞群，該組群的菌株與P. asparagi 的ITS 序列差異較大，它們之間的親緣關(guān)系較遠;而單獨聚在Ⅲ組群的寄生草莓的P. obscurans 菌株與P. asparagi 的ITS 序列差異最大，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠。

圖2 基于P. asparagi 及其近似種的rDAN-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of P. asparagi and related speices based on their rDAN-ITS sequences

3 討論

擬莖點霉屬真菌已描述有400 多個種［22］，主要為植物致病菌、植物內(nèi)生菌或腐生菌，甚至危害人和動物［23］，其分類主要依據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和寄主范圍［24］，但其分子進化關(guān)系尚不十分清楚。rDNA-ITS 序列已廣泛應(yīng)用于真菌的分子鑒定、親緣關(guān)系分析及系統(tǒng)發(fā)育研究。陳永青等［25］采用rDNAITS 序列分析法對寄生在木棉、發(fā)財樹、榴蓮、番石榴、芒果、楊梅、柚等植物上的擬莖點霉屬7 個種15個菌株進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，但未涉及P. asparagi。楊迎青等［7］對河北、江西、海南、山東和福建等5 省區(qū)的天門冬擬莖點霉的形態(tài)特征及ITS 序列進行分析，證實了P. asparagi 存在地域差異，但未研究P.asparagi 與近似種如P. viticola、P. longicolla、P. obscurans、P. vexans、P. fukushii 等的分子進化關(guān)系。本研究探明了P. asparagi 與寄生在蔬菜、水果和經(jīng)濟林木等植物上的擬莖點霉屬重要種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為P. asparagi 的分子鑒定及親緣關(guān)系分析提供一定的理論參考。

楊迎青等［7］研究認(rèn)為P. asparagi(JQ619526)與P. phyllanthicola(JN107737)聚在一起，且支持率達92%，它們的親緣關(guān)系最近，而本研究結(jié)果顯示，P. asparagi (KJ801804、KJ801805、KJ8018046、JQ070363)與P. phyllanthicola(JN107737)不聚在同一分支上，這可能與不同的P.asparagi 菌株有關(guān)。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，寄生紅豆杉的P. mali(KF574900)菌 株 與 寄 生 板 栗 的 P. castaneae(JF957786)菌株聚在同一分支上，且自展支持率為100%，表明它們的ITS 序列差異小，推測為異名同物，但有待對它們的形態(tài)特征進行分析驗證。同時，寄生大豆的P. longicolla(無性態(tài))菌株和寄生野生大豆的Diaporthe sojae(有性態(tài))菌株也聚在同一分支上，且自展支持率為100%，這與Gomes 等［23］報道它們屬于同1 個種是一致的。Zhang 等［26］認(rèn)為盡管序列有相似之處，但P. longicolla 與Diaporthe sojae 為不同的種，這可能與不同的分離菌株(P.longicolla 和Diaporthe sojae)存在差異有關(guān)。

本研究中用于分析的擬莖點霉菌株的ITS 序列有3 個為自測序列，其余大部分為已發(fā)表文獻中的ITS 序列，這為數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及代表性提供重要基礎(chǔ)，但它們的形態(tài)特征及生物學(xué)特性等差異有待進一步的比較分析。

［1］ 陳 罡，管安琴，盧昱宇，等.鹽脅迫對不同基因型蘆筍萌發(fā)的影響及鹽堿地育苗技術(shù)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(8):136-138.

［2］ ZHANG Y P，CHEN G G，LUO S C，et al. Stress physiology and virulence characterization of Phomopsis asparagi (Sacc.)bubak isolated from asparagus in Jiangxi province of China［J］. Aricultural Science ＆ Technology，2012，13(7):1502-1508.

［3］ SACCARDO P A. Fungi veneti novi vel critici vel mycologiae venetae addendi［J］. Seriei VIII. Michelia，1878，1:239-275.

［4］ BUBAK F. Zweiter beitrag zur pilzflora von montenegro［J］. Bull Herb Boissier Ser，1906，2(6):393-408.

［5］ 鄭元梅，陳福如，陳賽云，等.蘆筍莖枯病的研究Ⅰ，癥狀，侵染期及侵菌源［J］.江西植保，1987 (1):7-10.

［6］ 王元珪，王述彬.蘆筍莖枯病的初步研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988(3):30-31.

［7］ 楊迎青，李湘民，孟 凡，等.蘆筍莖枯病菌的鑒定及區(qū)域差異性分析［J］.植物保護學(xué)報，2012，39(4):315-320.

［8］ 張岳平，瞿華香，羅紹春，等. 一些重要作物擬莖點霉屬病原生物學(xué)及致病機制研究概況［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29(33):327-332.

［9］ ELENA K. First report of Phomopsis asparagi causing stem blight of asparagus in Greece［J］. Plant Pathology，2006，55(2):300.

［10］ DAVIS R D. Asparagus stem blight recorded in Australia［J］.Australasian Plant Pathology，2001，30(2):181-182.

［11］ 路廣明.蘆筍莖枯病的癥狀及防治方法［J］. 蔬菜，2001(9):26.

［12］ 林添發(fā). 蘆筍莖枯病的預(yù)測預(yù)報［J］. 福建農(nóng)業(yè)科技，2001(4):27.

［13］ 苗華民，侯緒友，盂凡明，等.蘆筍莖枯病病原菌及其生物學(xué)研究［J］. 植物保護學(xué)報，1991，18(1):87-90.

［14］ 陳慶和，翁啟勇，王源超，等.福建省大豆疫病病原鑒定及其核糖體DNA-ITS 序列分析［J］.植物病理學(xué)報，2004，34(2):112-116.

［15］ 胡中會，趙立華，嚴(yán)恩平，等.云南煙草赤星病菌及近似種rDNA-ITS 序列分析［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，27(5):670-676.

［16］ 樓兵干，張炳欣. 基于rDNA ITS 序列探討部分腐霉種的系統(tǒng)發(fā)育與其形態(tài)特征［J］.菌物學(xué)報，2005，24(2):207-220.

［17］ MURALI T S，SURYANARAYANAN T S，GEETA R. Endophytic Phomopsis species:host range and implications for diversity estimates［J］. Canadian Journal of Microbiology，2006，52(7):673-680.

［18］ KANEMATSU S，MINAKA N，KOBAYASHI T，et al. Molecular phylogenetic analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer regions and comparison of fertility in Phomopsis isolates from fruit trees［J］. Journal of General Plant Pathology，2000，66(3):191-201.

［19］ 方中達. 植病研究方法［M］. 3 版. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［20］ 盧松茂，羅金水，李麗容. 蘆筍莖枯病菌鑒定及寄主范圍研究［J］.福建熱作科技，2010，35(3):4-6.

［21］ 羅金水，張漢榮，盧松茂，等.琯溪蜜柚黑斑病菌分離鑒定及其致病性測定［J］.福建熱作科技，2011，36(4):1-5.

［22］ 陸家云.植物病原真菌學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［23］ GOMES R R，GLIENKE C，VIDEIRA S I R，et al. Diaporthe:a genus of endophytic，saprobic and plant pathogenic fungi［J］. Persoonia:Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi，2013，31:1-41.

［24］ UDAYANGA D，LIU X，MCKENZIE E H C，et al. The genus Phomopsis:biology，applications，species concepts and names of common phytopathogens［J］. Fungal Diversity，2011，50(1):189-225.

［25］ 陳永青，姜子德，戚佩坤.RAPD 分析與ITS 序列分析在擬莖點霉分類鑒定上的應(yīng)用［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21(1):39-46.

［26］ ZHANG A W，RICCIONI L，PEDERSEN W L，et al. Molecular identification and phylogenetic grouping of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybean［J］. Phytopathology，1998，88(12):1306-1314.