王政祿，鄭虹（.天津市第一中心醫(yī)院病理科，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 3009）

肝干細(xì)胞（hepatic stem cell，HSC）是一類具有同時向肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞分化和增殖以及自我更新潛能的原始細(xì)胞，當(dāng)肝實質(zhì)損傷尤其是肝臟大部分切除后，HSC會發(fā)生分化和高效增殖，參與到肝臟的再生和修復(fù)過程中，為機體細(xì)胞的更新提供潛在的無限細(xì)胞來源。相對于手術(shù)而言，HSC治療具有損傷小、并發(fā)癥少的優(yōu)勢，為終末期肝病的治療提供了嶄新的思路［1］。本文就HSC的研究和治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HSC的分類

目前認(rèn)為，HSC按照其來源可分為肝源性和非肝源性兩種。肝源性HSC來源于前腸內(nèi)胚層，在胚胎發(fā)育過程中以胚胎肝細(xì)胞形式存在，在成年哺乳動物中以膽管源性肝卵圓細(xì)胞形式存在，包括肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell，HOC）、小肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞（maturity hepatocyte，MH）。非肝源性HSC主要來源于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）、骨髓造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞等［1-2］。

1.1 肝源性HSC

1.1.1 HOC：Farber 1956年將肝內(nèi)具有分化潛能的細(xì)胞描述為卵圓細(xì)胞。當(dāng)肝實質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重受損和（或）肝功能紊亂時，HOC被激活，進(jìn)一步增殖、分化成肝細(xì)胞和（或）膽管細(xì)胞，從而完成肝臟結(jié)構(gòu)和功能的重建［3］。目前，普遍認(rèn)為HOC是肝祖細(xì)胞，但對其來源、增殖、調(diào)控分化及其與肝臟疾病的關(guān)系仍缺乏深入了解。研究發(fā)現(xiàn)，HOC與骨髓干細(xì)胞有許多相同的表面標(biāo)志物，如Thy-1、Flt-3R、c-Kit、CD34等，提示HOC可能來源于骨髓［4-5］，但也有學(xué)者認(rèn)為HOC來源于肝臟非實質(zhì)細(xì)胞［6］。

1.1.2 小肝細(xì)胞樣祖細(xì)胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC）：SHPC為直徑 9 ～ 12 nm 的單核細(xì)胞，其形態(tài)介于肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞之間，多在肝臟嚴(yán)重受損的情況下出現(xiàn)。胚胎發(fā)育晚期肝祖細(xì)胞首先分化為SHPC，然后在細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)因子作用下分化成熟，成體肝臟HOC先分化為SHPC，再進(jìn)一步分化為成熟的肝細(xì)胞［7］，Sasaki等［8］認(rèn)為SHPC是可以分化成為成熟肝細(xì)胞的定向祖細(xì)胞，在培養(yǎng)基中可以選擇性增殖，因此推測SHPC可能是肝細(xì)胞的特異性祖細(xì)胞。

1.1.3 MH：以往認(rèn)為MH為終末細(xì)胞，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，MH是具有增殖和分化潛能的干細(xì)胞。MH在體外培養(yǎng)中，在一定條件下可表達(dá)不同胚層（間葉、神經(jīng)和造血）前體細(xì)胞標(biāo)志物，如CK7、連接蛋白43（connexin 43）、NCAM、AFP、nestin和Thy1，表明其具有巨大的可塑性和分化潛能［9］。有研究顯示，MH可自我復(fù)制70次以上，而且具有歸巢能力［10］。

1.2 非肝源性HSC

1.2.1 ESC：ESC為增殖能力最強的全能干細(xì)胞，是一種高度未分化細(xì)胞，能誘導(dǎo)分化為3個胚層的各種細(xì)胞。Teratani等［11］在誘導(dǎo)因子作用下將小鼠ESC分化為有功能的MH，并移植到小鼠肝損傷模型體內(nèi)，通過熒光示蹤劑發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞廣泛分布于損傷的肝臟內(nèi)，并大量增殖。Shraki等［12］研究也表明，在不同的培養(yǎng)條件下，ESC可以分化為肝細(xì)胞。目前，人ESC向肝臟分化多采用擬胚體法（EB）［13］，其最大的特點是具有空間三維結(jié)構(gòu)，與胚胎發(fā)育過程相仿，但EB的分化隨機性較強，肝細(xì)胞誘導(dǎo)效率不高［14］。Malhi等［15］從人胎肝中分離出一種上皮祖/干細(xì)胞，它具有很強的集落形成能力，在培養(yǎng)條件下可增生數(shù)月，而且細(xì)胞分裂40次以上仍能保持正常核型，在聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi)可分化為MH。

1.2.2 骨髓干細(xì)胞：目前的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓干細(xì)胞至少包括兩種類型干細(xì)胞：造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），它們在特定條件下可分化為多功能祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC），進(jìn)而分化成不同種類的細(xì)胞，如肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞等［16］。研究顯示，BMSC具有體外易獲得、來源可靠、免疫原性較弱且移植后不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點［17-18］。BMSC可遷移、歸巢至肝細(xì)胞內(nèi)，定向分化為有功能的肝樣細(xì)胞和膽管細(xì)胞，參與肝臟的損傷修復(fù)、細(xì)胞更新和功能重建等病理生理過程［19-20］。BMSC可通過調(diào)解多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制肝星狀細(xì)胞增殖及活化、促使基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）高表達(dá)，從而抑制膠原合成、降解細(xì)胞外基質(zhì)、減輕肝纖維化，以改善肝功能［21］。此外，BMSC還能分泌白蛋白，使血清中白蛋白水平升高［22］。BMSC來源充足，可直接來源于成人的骨髓或外周血，采集方便，且自體移植不存在倫理上的爭議，因此是干細(xì)胞移植的理想選擇［23］。有研究表明，BMSC不僅能通過再生細(xì)胞來恢復(fù)肝細(xì)胞代謝功能，還能分泌MMP來降解肝臟間質(zhì)纖維組織，改善肝臟纖維化和肝硬化［24］。姜雪明等［25］研究顯示，BMSC療法在臨床移植領(lǐng)域中是一項很有前途的治療策略，由BMSC分泌的吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）是促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞生成和延長移植物存活的關(guān)鍵因素。

1.2.3 其他來源干細(xì)胞：其他來源干細(xì)胞包括胰島祖細(xì)胞、唾液腺祖細(xì)胞等［1］。Burke 等［26］利用地塞米松體外誘導(dǎo)胰島祖細(xì)胞表達(dá)肝蛋白，并轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，提示在胚胎發(fā)育過程中，一些原始的多能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)滯留在機體組織中。

2 HSC的采集與疾病治療

2.1 HSC的分離和采集：目前，臨床上最常用的是BMSC治療終末期肝病，BMSC的提取和分離是治療的前提，供體細(xì)胞的質(zhì)量則直接影響治療效果。BMSC的提取通常在髂前上棘或髂后上棘進(jìn)行，抽取骨髓50 ～ 100 ml，并以4 000 U肝素抗凝。BMSC的分離方法有負(fù)收集混合法、流式細(xì)胞儀法、Percoll法、貼壁篩選法、密度梯度離心法和免疫磁珠分離法等。Percoll法和免疫磁珠分離法是兩個最常用的方法［24］。Percoll法的原理是將蛋白酶選擇性地與非靶細(xì)胞結(jié)合，使非靶細(xì)胞表面活性發(fā)生變化，細(xì)胞密度發(fā)生改變，利用密度梯度離心方法分離所需細(xì)胞，其優(yōu)點是不損傷干細(xì)胞，表面無任何標(biāo)志物，能完整保持干細(xì)胞活性，是目前值得推薦的方法之一。免疫磁珠分離法是利用磁珠顆粒活性基團(tuán)在一定條件下與細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物結(jié)合及解離的原理，將BMSC分為陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞。收集CD45細(xì)胞，錐蟲藍(lán)拒染計數(shù)免疫磁珠分離前后細(xì)胞活力［27］，其優(yōu)點是干細(xì)胞回收率高、純度好、能保障足夠的細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力，在臨床應(yīng)用中取得了理想的治療效果。

2.2 HSC的移植途徑：BMSC移植治療肝損傷的途徑很多，包括肝動脈注射、門靜脈注射、脾臟內(nèi)或腹腔內(nèi)移植等，臨床上以肝動脈注射最為常用。影像引導(dǎo)下腹膜腔穿刺移植的優(yōu)點是創(chuàng)傷較小、移植細(xì)胞數(shù)量多，缺點是BMSC在腹腔內(nèi)較難存活。經(jīng)皮肝內(nèi)靜脈穿刺套管插入術(shù)是在超聲、CT或透視引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺到肝內(nèi)門靜脈，造影明確后引入套管，同時緩慢輸注移植細(xì)胞，注射細(xì)胞期間密切監(jiān)測門靜脈壓力，注射完畢后給予肝素抗凝以防止門靜脈血栓形成，術(shù)后給予以凝血酶飽和的海綿栓塞穿刺針道。經(jīng)門靜脈注射BMSC符合肝臟組織學(xué)及生理學(xué)特點，與其他途徑相比，細(xì)胞更易進(jìn)入肝竇；從生理學(xué)角度看，門靜脈是肝臟的營養(yǎng)靜脈，門靜脈血中的營養(yǎng)成分對BMSC有益，肝臟本身的微循環(huán)也可以調(diào)節(jié)其分化，但移植細(xì)胞可能導(dǎo)致門靜脈栓塞。為降低門靜脈栓塞等并發(fā)癥的發(fā)生率，需要對 BMSC 的數(shù)量進(jìn)行控制［28-29］。Salama等［30］報道了48例經(jīng)皮穿刺肝內(nèi)門靜脈插管移植HSC的患者，其中42例1次穿刺成功。目前，肝動脈介入插管技術(shù)已日臻成熟，通過該途徑可方便地將分離純化后的BMSC懸液直接輸注至肝臟，其優(yōu)點是符合介入移植的動脈插管途徑，而且不受細(xì)胞濃度及數(shù)量的影響，因此，國內(nèi)臨床多采用此途徑［31-33］。

2.3 HSC與肝臟疾病治療

2.3.1 急慢性肝功能衰竭（肝衰竭）：急慢性肝炎、肝硬化等導(dǎo)致的急慢性肝衰竭發(fā)生率和病死率較高。目前，肝移植仍然是治療終末期肝病的主要治療措施，但供體缺乏、費用較高等因素限制了其應(yīng)用，行HSC移植治療成為最佳治療手段。骨髓HSC已經(jīng)開始臨床應(yīng)用研究，特別是BMSC，因其具有體外易得、來源可靠、免疫原性較弱且移植后不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，無論是在動物實驗，還是人體BMSC體外培養(yǎng)及臨床應(yīng)用研究中均取得了較好的效果［34-35］。該治療手段能夠減輕肝纖維化，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，修復(fù)肝損傷，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［36-37］，故成為治療肝病的研究熱點。

2.3.2 代謝性肝臟疾病：代謝性肝病通常是由于遺傳性酶缺陷導(dǎo)致體內(nèi)毒性代謝產(chǎn)物堆積，繼而對機體產(chǎn)生毒性作用的一組先天性肝臟疾病。目前，臨床上普通的治療效果較差。但是，隨著HSC研究的發(fā)展，這類疾病將會獲得良好的治療效果?？死锔窭?納賈爾綜合征Ⅰ型鼠模型接受50Gy光照射然后再給予HSC移植，檢驗指標(biāo)提示鼠克里格勒-納賈爾綜合征Ⅰ型已臨床治愈［30］。

2.3.3 肝臟移植手術(shù)的輔助治療：由于肝臟手術(shù)往往經(jīng)歷了缺血/再灌注損傷（IRI）及術(shù)后各種免疫損傷，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及移植肝的長期存活率。鑒于BMSC的生物學(xué)特性，目前已將其應(yīng)用于肝移植術(shù)后輔助治療的臨床研究中。2011年日本學(xué)者研究證實了BMSC通過抑制肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞再生來明顯減輕大鼠IRI［38］。Ismail等［39］通過比較肝切除手術(shù)前接受與未接受自體HSC移植治療的兩組患者發(fā)現(xiàn)，術(shù)前接受HSC移植患者術(shù)后肝功能指標(biāo)恢復(fù)明顯優(yōu)于后者，且未發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥。由此可見，肝移植聯(lián)合干細(xì)胞移植可有效減輕IRI及排斥反應(yīng)的發(fā)生，并可減少免疫抑制劑的使用。

3 問題與展望

HSC的研究雖然已經(jīng)進(jìn)入一個新的階段，但由于自體BMSC移植開展時間不長，因此仍有大量的難題需要研究和解答，例如肝細(xì)胞在實際的分離純化及特異性標(biāo)志物鑒定過程中的進(jìn)一步優(yōu)化，在誘導(dǎo)分化成為成熟干細(xì)胞過程中各種細(xì)胞刺激因子及其他因素的調(diào)控作用機制，及HSC移植到活體肝臟中后各種微環(huán)境的具體作用機制等。同時，HSC移植途徑、部位、移植細(xì)胞數(shù)量等移植標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范化也有待于建立。隨著對HSC研究的不斷深入，我們相信HSC移植治療晚期肝病的應(yīng)用前景會非常廣闊，必將在各種肝臟疾病尤其是晚期肝病的治療領(lǐng)域中開辟新的途徑［24，40］。