姚德冬，柴毅，王毅，郭坤，黃俊 （長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025）

血細(xì)胞是魚(yú)類機(jī)體免疫的重要組成部分，對(duì)維持魚(yú)類機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用，其部分參數(shù)可反映魚(yú)類的健康狀況［1］。國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于魚(yú)類血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究［2～9］。

中華鱘 （Acipenser sinensis）隸屬鱘形目 （Acipenseriformes）鱘科 （Acipenseridae）鱘屬 （Acipenser），主要分布在長(zhǎng)江流域，是典型的溯河洄游魚(yú)類。由于過(guò)度捕撈、葛洲壩等水利工程建設(shè)、江上作業(yè)和水域污染等原因，中華鱘野生種群數(shù)量急劇下降，1988年中華鱘被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物［10］。目前有關(guān)中華鱘的研究報(bào)道主要集中在人工繁殖、行為學(xué)、生理生化等方面的研究［11～13］，但是專門對(duì)中華鱘外周血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究比較少。本研究對(duì)中華鱘血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，旨在為中華鱘血液學(xué)、疾病診斷的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

選取4尾養(yǎng)殖中華鱘進(jìn)行血液樣品采集。實(shí)驗(yàn)魚(yú)健康狀況良好，均為雌性，體長(zhǎng)162～182cm，體重20．7～36．7kg。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 采血方法

用帆布擔(dān)架撈取實(shí)驗(yàn)魚(yú)后，腹部朝上，鰓部供水。擦去臀鰭后的水分，用5mL 一次性注射器自尾鰭基部下方的尾靜脈抽取靜脈血2mL，迅速將血液注入附有EDTA－K2的抗凝管中，顛倒180度5～8次混勻后，放入4℃冷藏箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室待測(cè)。

1．2．2 紅細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)

按林浩然［14］的方法進(jìn)行。

1．2．3 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測(cè)量

抗凝血在干凈載玻片上涂片，晾干，用瑞氏－吉姆薩染液聯(lián)合染色。在Leica顯微鏡油鏡下進(jìn)行血細(xì)胞觀察、測(cè)量細(xì)胞大小，用南京倍寧醫(yī)學(xué)病理成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。每尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)制作2張血涂片，每張涂片上計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞，對(duì)1600個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。在測(cè)量細(xì)胞大小時(shí)，除數(shù)量極少的嗜酸性粒細(xì)胞外，其余各種血細(xì)胞大小取50次測(cè)量平均值。

1．3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （Mean±SD）表示；照片用Photoshop 7．0進(jìn)行處理，同比例縮放圖像和標(biāo)尺。

2 結(jié)果與分析

2．1 中華鱘外周血細(xì)胞的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)

通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，中華鱘血涂片中紅細(xì)胞的數(shù)量最多，白細(xì)胞數(shù)量較少且單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)聚集分散在紅細(xì)胞之間。白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞。

2．1．1 紅細(xì)胞 （erythrocyte）

紅細(xì)胞呈橢圓或卵圓形，表面光滑；細(xì)胞核形狀與細(xì)胞形狀相似，位于細(xì)胞中央，少數(shù)略偏位，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無(wú)核仁，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。部分血涂片染色過(guò)程中環(huán)境偏堿性，細(xì)胞呈灰藍(lán)色。此外，還觀察到紅細(xì)胞裂解后形成的 “核影”，被染成粉紅色 （圖1（a））。

2．1．2 淋巴細(xì)胞 （lymphocyte）

淋巴細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，占據(jù)多半細(xì)胞空間。細(xì)胞質(zhì)較少，有的呈一薄層包裹細(xì)胞核，有的向外伸出形成明顯的偽足突起 （圖1 （b）），有的不可見(jiàn)，細(xì)胞近似裸核 （圖1 （b））。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密呈塊狀，被染成深紫色，細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色。

2．1．3 血栓細(xì)胞 （thrombocyte）

血栓細(xì)胞呈長(zhǎng)桿形 （圖1 （c）、（d）、（e））、圓形 （圖1 （c））或橢圓形，表面光滑。細(xì)胞核呈長(zhǎng)桿形、橢圓形或腎形等，位于細(xì)胞中央，少數(shù)偏位，細(xì)胞質(zhì)較少，僅一薄層包裹細(xì)胞核；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密，被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)染色較淡，呈粉紅色，血栓細(xì)胞在血涂片中常見(jiàn)到單個(gè)或數(shù)個(gè)聚集在一起出現(xiàn)（圖1 （d））。

2．1．4 單核細(xì)胞 （monocyte）

單核細(xì)胞呈橢圓形、圓形或不規(guī)則形。細(xì)胞核形狀多種多樣，包括圓形、橢圓形、腎形或馬蹄形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)較豐富；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無(wú)核仁，細(xì)胞質(zhì)被染成灰藍(lán)色，染色不均勻且含有空泡 （圖1 （e）、（f））。在顯微鏡下，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有時(shí)難以區(qū)分，前者染色質(zhì)疏松不勻，細(xì)胞質(zhì)染色灰藍(lán)色，朦朧模糊，而后者染色質(zhì)致密呈塊，染色質(zhì)淺藍(lán)色，清晰透明（圖1 （f））。

2．1．5 嗜中性粒細(xì)胞 （neutrophil）

嗜中性粒細(xì)胞呈圓形、卵圓形 （圖1 （g））或不規(guī)則形 （圖1 （h））等，細(xì)胞核為腎形、馬蹄形或分葉形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)與細(xì)胞膜相切，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無(wú)核仁，細(xì)胞質(zhì)染色較淺，呈淡粉紅色，有的甚至是無(wú)色。

2．1．6 嗜酸性粒細(xì)胞 （eosinophil）

嗜酸性粒細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核為腎形或分葉形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密，被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)中充滿了均勻飽滿的嗜酸性顆粒，被染成橘紅色。在血涂片中偶爾見(jiàn)到，數(shù)量極少。

圖1 中華鱘外周血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

2．2 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測(cè)定

中華鱘白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出，在細(xì)胞數(shù)量上，中華鱘白細(xì)胞中以血栓細(xì)胞數(shù)量最多，占白細(xì)胞總數(shù)48．56%；其次是淋巴細(xì)胞，占白細(xì)胞總數(shù)32．44%；嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分別占10．25%和8．38%；嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量最少，僅占白細(xì)胞總數(shù)0．37%，極為少見(jiàn)。在細(xì)胞大小上，中華鱘白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞的體積最大，其細(xì)胞大小為 （20．29±1．62）μm× （16．07±2．89）μm；細(xì)胞核大小為 （16．32±1．54）μm× （12．34±2．27）μm；淋巴細(xì)胞的體積最小，其細(xì)胞大小為 （9．74±2．65）μm× （7．20±0．97）μm；細(xì)胞核大小為 （8．34±1．24）μm×（6．83±0．74）μm。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為 （4．82±0．15）×1011個(gè)／L。

表1 中華鱘各類血細(xì)胞大小和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)值

3 討論

3．1 中華鱘血細(xì)胞組成

中華鱘外周血中紅細(xì)胞數(shù)量占大多數(shù)，白細(xì)胞數(shù)量較少。林光華等［15］認(rèn)為淡水養(yǎng)殖魚(yú)類血液白細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，但在中華鱘白細(xì)胞中，血栓細(xì)胞數(shù)量最多，這與美國(guó)紅魚(yú) （Sciaenops ocellatus）［16］、淡水石斑 （Cichlasoma managuense）［17］、軍曹魚(yú) （Rachycentron canadum）［2］、長(zhǎng)鰭裸頰鯛（Lethrinus erythropterus）［5］、切尾擬鲿 （Pseudobagrus truncatus）［4］、小點(diǎn)貓鯊 （Scyliorhinus canicula）［8］、澳洲黑鯛 （Acanthopagrus australis）［7］等相同。嗜酸性粒細(xì)胞最少，這與稀有白甲魚(yú) （Onychostoma rara）［6］、淡水石斑［17］、切尾擬鲿［4］等情況相似。粒細(xì)胞中，嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均存在，但并未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，這與稀有白甲魚(yú)［6］、淡水石斑［17］、華鯪 （Sinilabeo rendahli）［18］、切尾擬鲿［4］等結(jié)果一致；但美國(guó)紅魚(yú)［16］、犬牙韁蝦虎魚(yú) （Amoya caninus）［3］、斑點(diǎn)叉尾鮰 （Ietalurus punetaus）［19］、長(zhǎng)鰭裸頰鯛［5］的外周血液中均發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。Watson等［20］認(rèn)為嗜堿性粒細(xì)胞在制片過(guò)程中極易解體，很難觀察到。林光華等［21］則發(fā)現(xiàn)草魚(yú) （Ctenopharyngodon idellus）嗜堿性粒細(xì)胞只在幼齡魚(yú)魚(yú)種出現(xiàn)，在成年魚(yú)外周血液中沒(méi)有。周玉等［22］指出魚(yú)類白細(xì)胞分類存在種間差異。本研究中未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞解體，也可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)魚(yú)不是幼魚(yú)，或者中華鱘血液中沒(méi)有嗜堿性粒細(xì)胞，具體原因需進(jìn)一步研究。

3．2 中華鱘與其他鱘魚(yú)的血細(xì)胞特征比較

中華鱘的外周血液中發(fā)現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞，并未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，這與達(dá)氏鰉 （Huso dauricus）［23］、高 首 鱘 （Acipenser transmontanus）［19］研 究 結(jié) 果 一 致；但 是 在 史 氏 鱘 （Acipenser schrenckii）［24］研究中，發(fā)現(xiàn)其血細(xì)胞中有嗜堿性粒細(xì)胞，沒(méi)有嗜酸性粒細(xì)胞。中華鱘血細(xì)胞中，嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞體積較大，淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞較小，與達(dá)氏鰉研究結(jié)果一致，但是中華鱘外周血細(xì)胞數(shù)量少于達(dá)氏鰉，中華鱘血細(xì)胞體積大于達(dá)氏鰉，這可能跟2種鱘魚(yú)的年齡、生活環(huán)境等有關(guān)。

本研究在白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)將血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞，而在達(dá)氏鰉［23］、史氏鱘［24］的研究中并未將血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞；作者在光鏡下發(fā)現(xiàn)中華鱘淋巴細(xì)胞大小、著色及形態(tài)特征均無(wú)明顯差異，將其歸為一類細(xì)胞；章龍珍等［24］也沒(méi)有對(duì)史氏鱘的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類，但是周玉等［23］通過(guò)電鏡對(duì)淋巴細(xì)胞內(nèi)的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核孔和核周隙的觀察，將達(dá)氏鰉的淋巴細(xì)胞分為大小2類。因此，中華鱘和達(dá)氏鰉、史氏鱘的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果不便比較。

魚(yú)類白細(xì)胞分類仍然有很大爭(zhēng)議。在軍曹魚(yú)［2］、犬牙韁蝦虎魚(yú)［3］、切尾擬鲿［4］等魚(yú)類研究中，血栓細(xì)胞都?xì)w為白細(xì)胞一類；而林光華等［15］將鰱 （Hypophthalmichthys molitrix）、鳙 （Aristichthys nobilis）的血栓細(xì)胞劃分到白細(xì)胞系以外。除血栓細(xì)胞的歸屬，淋巴細(xì)胞的分類也不相同。很多學(xué)者［3～5］將淋巴細(xì)胞分成大小2類；Barber等［25］認(rèn)為淋巴細(xì)胞體積是連續(xù)變化的，不能用 “大”、 “小”來(lái)界定；Ellis［26］也認(rèn)為不同大小的淋巴細(xì)胞可能是同一種細(xì)胞的不同功能狀態(tài)。作者認(rèn)同周玉等的觀點(diǎn)，對(duì)于魚(yú)類白細(xì)胞的分類應(yīng)采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，便于學(xué)術(shù)交流。

3．3 中華鱘血細(xì)胞特征與其生態(tài)適應(yīng)性

紅細(xì)胞是魚(yú)體內(nèi)運(yùn)輸氧氣的主要媒介。林浩然［27］指出魚(yú)類運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)弱與其紅細(xì)胞數(shù)量和大小有關(guān)；楊嚴(yán)鷗等［28］也認(rèn)為紅細(xì)胞數(shù)量由大到小的順序與魚(yú)類運(yùn)動(dòng)水平由高到底的順序是一致的。中華鱘紅細(xì)胞與常見(jiàn)的白鰱、鳙、草魚(yú)、鯉魚(yú) （Cyprinus carpio）等鯉科魚(yú)類紅細(xì)胞相比，數(shù)量要少，體積要大，說(shuō)明中華鱘游泳能力比上述鯉科魚(yú)類要弱；這與蔡露［29］在研究4種鱘科魚(yú)類游泳能力時(shí)得出的結(jié)果一致。中華鱘的紅細(xì)胞特征可能是其適宜在水流速度較慢的水底生活，以一些行動(dòng)遲緩的底棲動(dòng)物為食的原因。

魚(yú)類血栓細(xì)胞具有凝血功能，淋巴細(xì)胞是魚(yú)類機(jī)體免疫的重要組成部分。中華鱘的白細(xì)胞是以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主體的系統(tǒng)，兩者占白細(xì)胞總數(shù)的81%；這也可能與中華鱘是大型溯河洄游性魚(yú)類，在礫石底質(zhì)的江段產(chǎn)卵有關(guān)。遠(yuǎn)距離運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)卵過(guò)程中容易受傷，白細(xì)胞以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主體的系統(tǒng)，能夠使得中華鱘在受傷后快速凝血，并將侵入體內(nèi)的病原殺死，形成免疫保護(hù)。

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