張敬宜　王金華　熊智　思斯　王凱　楊應(yīng)勇

摘要：為研究和利用云南省文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤菌的種質(zhì)資源多樣性，對(duì)從文山地區(qū)豆科植物根瘤分離獲得的3株根瘤菌株進(jìn)行6S rDNA全序列分析，并與相關(guān)參比菌株的6S rDNA序列進(jìn)行比較及聚類分析，建立3株文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤菌的發(fā)育樹(shù)狀圖，初步確定3株豆科植物根瘤菌的分類地位，為以后石漠化生態(tài)修復(fù)中種植豆科植物接種適宜的根瘤菌提供種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：石漠化；豆科植物；根瘤菌；6S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)： S82；S56文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-0044-03

石漠化是指在喀斯特脆弱的巖溶生態(tài)環(huán)境下，由于人類不合理的社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)而造成的地表植被破壞、水土嚴(yán)重流失、土壤貧瘠、基巖裸露或礫石堆積等生態(tài)系統(tǒng)退化現(xiàn)象，是巖溶地區(qū)土壤退化的極端形式。石漠化地區(qū)干旱，土壤肥力下降，土地生產(chǎn)力衰減，嚴(yán)重影響了農(nóng)、林、牧業(yè)的生產(chǎn)，當(dāng)?shù)厝罕姷纳詈蜕a(chǎn)環(huán)境日趨惡化。云南省是我國(guó)石漠化主要分布區(qū)之一，石漠化土地總面積28820萬(wàn)hm2，占云南省國(guó)土總面積的535%。在個(gè)石漠化分布州（市）中，文山州居首位，石漠化總面積838萬(wàn)hm2，主要分布在廣南、丘北和文山等縣，是典型的峰叢洼地石漠化類型[2]。

根瘤菌是一類存在于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，它能夠侵染豆科植物的根部或莖部形成共生體——根瘤（或莖瘤），并在其中將空氣中的游離態(tài)的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成植物可以利用的化合態(tài)氮，為宿主植物的生長(zhǎng)提供必需的氮素營(yíng)養(yǎng)。根瘤菌-豆科植物共生固氮體系是已知固氮能力最強(qiáng)的生物固氮體系之一，能有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加土壤肥力[3]。因此，發(fā)現(xiàn)新的根瘤菌資源，建立高效的共生體系是石漠化地區(qū)植被恢復(fù)的首要工作。

目前許多學(xué)者對(duì)國(guó)內(nèi)很多地區(qū)的豆科植物根瘤菌進(jìn)行了研究[4-8]，但對(duì)文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤菌的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以文山石漠化地區(qū)的豆科植物為材料，調(diào)查這一特殊生境下的根瘤菌資源，研究其遺傳多樣性，篩選優(yōu)良根瘤菌，在石漠化生態(tài)恢復(fù)時(shí)，拌種于豆科植物的種子，與豆科植物形成共生固氮體系，為改良石漠化土壤、恢復(fù)石漠化生態(tài)環(huán)境提供優(yōu)質(zhì)種庫(kù)和有效途徑。

材料與方法

根瘤的采集

20年4月在云南省文山州廣南縣、文山市、丘北縣、硯山縣4個(gè)地區(qū)采集豆科植物，挖出根須，挑選新鮮、個(gè)大、飽滿的根瘤裝入裝有干燥變色硅膠的離心管，密封。供試菌株編號(hào)、宿主植物名稱及來(lái)源見(jiàn)表。

2根瘤菌的分離及篩選

根瘤帶回實(shí)驗(yàn)室后，用無(wú)菌水洗滌，以 75%乙醇3～5 min、0% HgCl2 ～3 min進(jìn)行表面滅菌，無(wú)菌水沖洗5～6次，然后在無(wú)菌條件下用滅菌的手術(shù)刀將根瘤切開(kāi)，并用滅菌的鑷子擠出汁液，最后接種于YMA培養(yǎng)基上，于28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。采用稀釋平板劃線法，分離純化，挑取單菌落，革蘭氏染色，鏡檢，最后接入試管斜面中保藏備用。

3DNA的提取

將活化的菌株接種于TY液體培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下、40 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，用細(xì)菌DNA試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA。

46S rDNA CR擴(kuò)增及測(cè)序

（）引物選擇。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′[9]，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。（2）反應(yīng)體系。0 μmol/L正向引物和反向引物各 μL，2×Taq CR MasterMix 25 μL，25 ng/L模板DNA 25 μL，加ddH2O至50 μL。（3）反應(yīng)程序。95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 min，56 ℃退火 min，72 ℃延伸3 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。（4）CR產(chǎn)物檢測(cè)。CR擴(kuò)增產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后將CR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序，測(cè)序工作在上海英濰捷基公司完成。

5多序列比較及進(jìn)化樹(shù)的建立

將測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心和歐洲生物信息所的國(guó)際網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行多序列比較，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

26S rDNA CR擴(kuò)增

圖顯示，通用引物對(duì)根瘤菌的DNA進(jìn)行6S rDNA擴(kuò)增后，均有 500 bp左右的擴(kuò)增條帶。

[FK（W9][TZYtif][FK）]

22序列測(cè)定結(jié)果

將菌株的6S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用軟件MEGA 40按bootstrap的UGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（表、表2、圖2）。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖上看，這3株菌屬于不同的歸屬，說(shuō)明文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤菌多樣性很豐富。有7株菌屬于Rhizobium sp系統(tǒng)發(fā)育分支，但它們分為兩大分支，SWFU-W0、SWFU-W02、SWFU-W03、SWFU-W0為一個(gè)分支，SWFU-W58、SWFU-W63、SWFU-W64為另一分支的根瘤菌屬（Rhizobium sp），其中來(lái)自不同采樣地相同寄主（三葉草）的代表菌株SWFU-W0、SWFU-W02、SWFU-W03，說(shuō)明在不同的生境中Rhizobium sp可以與寄主形成共生關(guān)系。SWFU-W3、SWFU-W4、SWFU-W50屬于熱帶根瘤菌屬（Rhizobium tropici），它們的寄主植物均為木本豆科植物木藍(lán)，但是木藍(lán)分別采集于文山市、廣南縣和硯山縣3個(gè)地區(qū)。SWFU-W90、SWFU-W98、SWFU-W99與根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的同源性最接近，它們與其他菌株的相似性也較?。ū?），故它們屬于根癌土壤桿菌。[FL）]

[FK（W5][HT6H][Z]表文山石漠化地區(qū)自然生長(zhǎng)的豆科植物根瘤菌[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK6，WK5，WK8，WK5，WK8。2W]序號(hào)菌株號(hào)寄主植物中文名植物學(xué)名采集地點(diǎn)生境

3討論

目前石漠化已經(jīng)成為導(dǎo)致西南巖溶地區(qū)生態(tài)惡化的主要因素，而人為破壞造成的地表植被覆蓋率下降是石漠化的根本原因，因此恢復(fù)植被是石漠化治理的首要任務(wù)。有機(jī)質(zhì)、N、、K、Ca、Mg等養(yǎng)分有效含量低是石漠化植被恢復(fù)的最主要障礙[0-]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)構(gòu)建根瘤菌-宿主植物共生體系，不僅能夠顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)還[FL）]

[FK（W2][TZY2tif][FK）]

[FL（2K2]能夠增加土壤肥力，改良土壤結(jié)構(gòu)。如李建華等在山西礦區(qū)復(fù)墾土壤上種植接種根瘤菌的白三葉草（Trifolium[KG3]repens），結(jié)果表明接種根瘤菌能顯著提高植物生物量和土壤養(yǎng)分利用率[2]；Requena等用根瘤菌接種絨毛花（Anthyllis cytisoides）幼苗，對(duì)西班牙南部一個(gè)半干旱沙漠地區(qū)的退化植被進(jìn)行恢復(fù)，發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌在提高植株在半干旱沙漠地區(qū)的定殖和存活能力、增加土壤的質(zhì)量和肥力、促進(jìn)自然群落演替過(guò)程中氮的轉(zhuǎn)移等方面效果最好[3]。根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系會(huì)因生態(tài)環(huán)境的差異而具多樣性[4-5]，因此，在應(yīng)用豆科植物-根瘤菌共生體系來(lái)修復(fù)石漠化退化地土壤和生態(tài)時(shí)，應(yīng)根據(jù)石漠生態(tài)環(huán)境及宿主植物兩方面因素選擇合適的根瘤菌，為豆科植物選擇最佳匹配的根瘤菌。本研究對(duì)文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤菌的分離鑒定，對(duì)建立石漠地區(qū)的根瘤菌菌庫(kù)和改善石漠化環(huán)境具有重要的意義。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[ZK（#]王代懿，容麗，梅再美，等 喀斯特石漠化生態(tài)治理區(qū)結(jié)構(gòu)與物種多樣性研究 水土保持通報(bào)，2005，25（2）：3-35

[2]羅文生，宋維峰，尹義發(fā) 云南石漠化防治現(xiàn)狀 亞熱帶水土保持，200，22（）：27-30，55

[3]Committee on a Study of Technologies to Benefit Farmers in Africa and South Asia，National Research Council Emerging technologies to benefit farmers in sub-Saharan Africa and South Asia[M] Washington DC：The National Academies ress，2008：45-76

[4]李穎，白雨，陳文新 沙坡頭地區(qū)根瘤菌DNA同源性及6S rDNA全序列 微生物學(xué)報(bào)，999，39（2）：95-99

[5]彭玉紅，焦如珍，牟新濤 尖峰嶺抗逆性根瘤菌的篩選及其6S rDNA序列的測(cè)定 林業(yè)科學(xué)研究，200，23（4）：530-536

[6]趙龍飛 河南商丘地區(qū)豆科植物根瘤菌資源多樣性調(diào)查 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，203，4（5）：329-332

[7]呂飛，蔣欣，徐佳潔，等 新疆和陜西三葉草屬根瘤菌6S rDNA多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育研究 草地學(xué)報(bào)，2009，7（3）：304-309[H85mm]

[8]龔秀會(huì)，繆?？。w平，等 云南東川銅礦區(qū)豆科植物-根瘤菌對(duì)銅的耐受性 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，202，40（6）：32-34

[9]Weisburg W G，Barns S M，elletier D A，et al 6S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study ournal of Bacteriology，99，73（2）：697-703[ZK）]

[0][ZK（#]袁道先 全球巖溶生態(tài)系統(tǒng)對(duì)比：科學(xué)目標(biāo)和執(zhí)行計(jì)劃 地球科學(xué)進(jìn)展，200，6（4）：46-466

王建鋒，謝世友，許建平 叢枝菌根在石漠化生態(tài)恢復(fù)中的應(yīng)用及前景分析 信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，22（）：57-60

[2]李建華，郜春花，盧朝東，等 接種根瘤菌的三葉草在礦區(qū)復(fù)墾土壤中的生態(tài)效應(yīng) 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，200，38（2）：55-56，67

[3]Requena N，erez-Solis E，Azcón-Aguilar C，et al Management of indigenous plant-microbe symbioses aids restoration of desertified ecosystems Applied and Environmental Microbiology，200，67（2）：495-498

[4]陳文峰，劉杰，陳文新 木本豆科植物根瘤菌資源及多樣性研究進(jìn)展 科學(xué)技術(shù)與工程，2004，4（）：954-959

[5]陳文峰，陳文新 我國(guó)豆科植物根瘤菌資源多樣性及應(yīng)用基礎(chǔ)研究 生物學(xué)通報(bào)，2003，38（7）：-4