龍麗坤+李飛武+李蔥蔥+武奉慈+宋新元

摘要：應用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）定量檢測轉基因玉米MON89034×NK603的3個復合性狀轉基因玉米中CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白在各組織中的表達量，分別取苗期和心葉期葉片、吐絲期花粉和花絲、灌漿期籽粒、雌穗頂端和莖髓組織進行檢測。結果顯示，3個轉基因品種中，外源基因在各組織中的表達顯示較高的一致性，均在葉片組織表達最高。轉化體同一組織中表達外源蛋白在品種間變異不明顯，組織間差異大于品種差異。

關鍵詞：復合性狀轉基因玉米；ELISA；外源蛋白；時空表達規(guī)律

中圖分類號： S53035文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0029-05

自998年首例轉基因玉米被批準商業(yè)化以來，轉基因玉米種植面積不斷擴大，隨著轉基因技術快速發(fā)展，新一代轉基因植物及復合性狀轉基因植物不斷涌現(xiàn)。20年，全球共有6個國家種植轉基因玉米，種植面積達到5 00萬hm2，占全球玉米種植總面積的32%?？瓜x耐除草劑復合性狀轉基因玉米種植面積近2年來不斷增長，202年種植面積達 2 029萬hm2，比20年增長09%。復合性狀轉基因玉米已逐漸取代了單一性狀轉基因玉米，成為市場主導[2]。然而，轉基因大面積種植后引起的生態(tài)環(huán)境安全等問題也引起了人們的廣泛關注[3-4]。因此，對復合性狀轉基因玉米在不同栽培條件下外源蛋白時空表達成為轉基因環(huán)境安全評價的關注焦點之一[5]。本試驗材料為孟山都公司選育的DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR等3個復合性狀轉基因玉米品種，這3個品種均以MON89034和NK603為親本雜交選育而成，具有來自父本的CryA05和Cry2Ab2殺蟲蛋白基因和母本的C4-ESS蛋白外源基因，表達雙價抗蟲和耐除草劑的復合性狀。本研究采用ELISA方法對3個復合性狀轉基因玉米不同時期、不同組織進行外源蛋白表達的實時檢測，研究復合性狀轉基因玉米抗蟲和耐除草劑基因的時空表達規(guī)律。同時，以本品種的同型對照品種以及當?shù)刂髟云贩N作為陰性對照開展外源蛋白組織表達測定，以期闡明雜交種外源蛋白時空表達規(guī)律，為雜交選育復合性狀轉基因玉米環(huán)境安全評價方案提供參考依據(jù)。

材料與方法

材料和試劑

陽性轉基因玉米材料3個，品種名為DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR，同型對照陰性玉米樣品分別為DK007、DK008和NC6304，由美國孟山都公司提供。當?shù)刂髟云贩N對照ZD958和C69為當?shù)卮筇锿茝V材料，購于種子公司。3個轉基因玉米材料均為MON89034（雙價抗蟲）和NK603（耐除草劑）雜交選育的復合性狀品種。

主要化學試劑采購于Sigma公司。

2田間試驗設計和取樣方法

2小區(qū)設計

NC6304YGRR和其同型對照NC6304、主栽品種對照ZD958種植于吉林省公主嶺市；DK007YGRR、DK008YGRR，同型對照DK007、DK008，主栽品種C69種植于廣西；每小區(qū)面積為30 m2（6 m×5 m），3次重復，隨機區(qū)組排列。

22播種時間與方法

吉林省202年5月2日播種，常規(guī)播種方式，播種后按當?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理模式進行管理。廣西壯族自治區(qū)202年4月20日播種，常規(guī)播種方式，播種后按當?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理模式進行管理。

23取樣方法

[3]分抽雄前、抽絲、灌漿初期和乳熟末期4個時期取樣，取樣部位：苗期葉片、心葉期葉片、花粉與花絲、籽粒、雌穗頂端和莖髓，取樣后用液氮速凍，-80 ℃低溫冰柜保存。

3ELISA試驗方法

3樣品處理和蛋白抽提

當在田間對測試材料的各個組織進行采樣后，當天放入實驗室-80 ℃低溫冰箱中進行保存，直至全部樣品采集完畢，開始樣品處理。樣品組織在處理時先粉碎成均勻的粉末樣本。樣品稱重后，對CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白用×BST進行提取。提取的蛋白樣品在6 h內進行測試時，保存在 4 ℃ 條件下，否則用小管分裝保存在-80 ℃條件下。

32C4-ESS蛋白檢測方法

單克隆小鼠抗C4 ESS抗體用含50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖液和 05 mol/L NaCl的溶液稀釋至20 g/mL，每孔加00 L稀釋的抗體在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育8 h以上。用× BST洗板3次，分別在各孔對應加入C4-ESS蛋白標準液、樣本提取液、標準品和樣品緩沖液00 L/孔，37 ℃下孵育 h。秸稈、葉片、花粉、花絲和根樣品提取液使用× BST/0% BSA溶液稀釋；籽粒樣品使用× TBA稀釋?！?BST 洗板3次，每孔加入00 L過氧化物酶偶聯(lián)的抗C4 ESS抗體，37 ℃孵育 h。用× BST洗板3次，向孔內加入00 L TMB，室溫靜置0 min，加入00 L 6 mol/L H3O4終止酶反應。C4-ESS蛋白水平定量通過繪制0456～4600 ng/mL的C4-ESS蛋白標準曲線用內插法確定。

33Cry2Ab2蛋白檢測方法

小鼠抗Cry2Ab2的捕獲抗體用包被緩沖液（92 μL單克隆抗體加到0 mL 50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3的緩沖液）稀釋，最終濃度為2 μg/mL，每孔加00 μL稀釋抗體在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育 8 h 以上。用×BST洗板3次，分別在各孔對應加入 00 μL Cry2Ab2蛋白標準液、樣品提取液、標準品和樣品緩[2]沖液（00 μL/孔），37 ℃孵育 h。×BST洗板3次，每孔加入00 μL生物素偶聯(lián)的山羊抗Cry2Ab2抗體和NeutrAvidin-HR（ierce）來檢測捕獲的Cry2Ab2?！?BST洗板3次，每孔加入00 μL TMB顯色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4終止酶活反應。通過繪制濃度為029～7000 ng/mL的Cry2Ab2蛋白標準曲線，用內插法完成定量。

34CryA05蛋白檢測方法[2]

山羊抗CryA05的捕獲抗體用包被緩沖液（50 mmol/L Na2CO3/NaHCO350 mmol/L NaCl）稀釋至終濃度3 μg/mL，每孔加00 μL稀釋抗體在96孔微孔板上固定，放入4 ℃冰箱中孵育8 h以上。用×BST洗板3次。進行籽粒樣本分析時，向各孔加00 μL含9%脫脂奶粉（NFDM）的×BST，再進行封閉，37 ℃孵育 30～90 min，用×BST洗板3次，其他組織樣本不進行此步驟。分別在各孔對應加入00 μL CryA05蛋白標準液或樣品提取液，37 ℃孵育 h。用×BST洗板3次，每孔加入 00 μL 生物素偶聯(lián)的山羊抗CryA05抗體和NeutrAvidin-HR（ierce）來檢測捕獲的CryA05。用×BST洗板3次，每孔加入00 μL HR底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4終止酶活反應。通過繪制0438～4000 ng/mL CryA05蛋白標準曲線，用內插法完成定量。

4數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

ELISA研究中采用Bio-rad iMarkTM 微孔板吸收光酶標儀進行檢測。CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白用波長450 nm時的吸光度和波長655 nm時的參考吸光度來確定其在樣品中的表達量，在計算時根據(jù)標準蛋白所建立的標準曲線和內插法。蛋白的標準濃度用四參數(shù)邏輯曲線模型確定曲線，用內插法確定CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白在各樣品中的含量，并將結果由ng/mL轉化為μg/g（鮮質量）。數(shù)據(jù)用ELISA軟件進行歸納分析。

2結果與分析

2組織中外源蛋白表達的差異顯著性分析

本試驗的3個復合性狀品種分別在吉林省和廣西壯族自治區(qū)兩地栽種，3個復合性狀轉化體，均為MON89034和NK603的雜交選育品種。3個轉基因玉米材料的遺傳背景的外源基因具有來自父本MON89034的雙價抗蟲基因（[WTBX][STBX]CryA05、Cry2Ab2[WTBZ][STBZ]）和來自母本的NK603耐除草劑基因（[WTBX][STBX]C4-ESS[WTBZ][STBZ]）。采樣時期分別為苗期（V4）、心葉期（V8）、吐絲期（R）和灌漿期（R3），各時期采集的組織為V4 葉片、V8葉片、R花粉和花絲，R3籽粒、穗尖（雌穗頂端）、莖髓（雌穗著生節(jié)莖稈），在各小區(qū)中對每個組織材料隨機選取5株進行蛋白提取。

對3個平行小區(qū)開展3次重復ELISA檢測，根據(jù)405 nm吸光度的數(shù)值在標準曲線中對照其蛋白在轉基因玉米植株中的外源蛋白表達含量。

表統(tǒng)計分析了3個復合性狀轉基因品種的 C4-ESS 蛋白在7個不同生長時期的組織中的表達情況，結果表明，同一組織內的蛋白表達在品種間多差異不顯著，特別是葉片組織，V4葉片（新鮮）和V8葉片（新鮮）的 C4-ESS 蛋白持續(xù)穩(wěn)定地高表達，均約為35 μg/g，其他組織在品種間或有差異，但各組織間表現(xiàn)了更大的差異顯著性，方差分析結果見表2。

表3分析了3個復合性狀轉基因品種的CryA05抗蟲蛋白在7個不同生長時期組織中的表達，該抗蟲蛋白在各組織中表達差異較大。統(tǒng)計分析結果表明，3個品種同一組織蛋白表達量不同， 但差異均不顯著，而組織間V4葉片、V8葉[FL）]

可見，復合性狀的轉化體組織表達外源蛋白在轉化個體間變異不明顯，其表達量與表達蛋白種類有關。組織間的差異大于品種差異，栽培種植條件也是影響其蛋白表達的原因之一。

22抗蟲和耐除草劑基因在轉化體中的蛋白表達

由圖、圖2、圖3可見，轉基因植株中耐除草劑蛋白 C4-ESS 在V4葉片、V8葉片、花粉、莖髓、穗尖、籽粒中表達量均高于CryA05、Cry2Ab2抗蟲蛋白，只有在花絲中3種蛋白表達量均較低的情況下，Cry2Ab2蛋白表達量略高于C4-ESS。

CryA4、Cry2Ab2 2種抗蟲蛋白的表達量在3個品種中表現(xiàn)趨勢也較明顯，CryA05抗蟲蛋白在V4葉片、V8葉片、花粉、穗尖組織中的表達量高于Cry2Ab2抗蟲蛋白；僅在3個品種的花絲、廣西品種DK007YGRR和DK008YGRR莖髓和籽粒中，Cry2Ab2表達的抗蟲蛋白量略高于CryA05。

因此，3個品種顯示的耐除草劑和抗蟲蛋白的組織表達規(guī)律一致，其外源蛋白的表達量可能與在其親本來源有關，在親本中的基因插入位置和表達調控可直接影響到其在雜交品種中的表達。

23植物各組織中外源蛋白的鮮質量含量

如圖4、圖5、圖6所示，3個復合性狀品種DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR在各組織中表達情況也顯示出較高的一致性，即營養(yǎng)器官組織（V4葉片、V8葉片）的外源蛋白表達量均高于生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）。V4葉片中3種外源蛋白表達最高，V8葉片其次，這一結果可能與葉片中可溶性蛋白含量較高有關。[2]

在3個轉化體中，NC6304YGRR各時期的植物組織器官中CryA05蛋白表達量最高，DK007YGRR其次，DK008YGRR中表達相對較低。

在植物的營養(yǎng)器官中，NC6304YGRR的Cry2Ab2蛋白表達量最高，而生殖生長階段中NC6304YGRR生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）中Cry2Ab2蛋白表達量均低于DK008YGRR。

在苗期和心葉期，3種轉化體葉片中C4-ESS蛋白表達量最高，其中V4葉片時期略大于V8葉片時期，這種情況可能與前期轉化體篩選有關。這一時期葉片的高表達量為草甘膦噴施效果提供了有效保證。

24植物生長條件對轉化體外源蛋白組織表達的影響

NC6304YGRR是在吉林種植和栽培管理的玉米品種，DK007YGRR、 DK008YGRR在廣西栽培種， 因此植株生長的

環(huán)境條件有所不同。生長在吉林的NC6304YGRR 的CryA05蛋白表達量基本均大于生長于廣西的DK007YGRR、DK008YGRR。Cry2Ab2蛋白和C4-ESS蛋白表達量兩地各不相同，無明顯規(guī)律。復合性狀轉基因品種各組織中的外源蛋白表達量存在差異，且在相同條件栽種的DK007YGRR、DK008YGRR蛋白表達量同樣存在差異，但差異較小。

3結論與討論

轉基因植株外源基因蛋白在不同生育期不同組織器官表達不同[6]，既可能與外界栽培條件有關，也可能與外源基因整合的位點有關[7]。當外源基因整合到與生長發(fā)育有關的基因附近，外源基因的表達就會受生長發(fā)育基因調控序列的調控，隨著生長時期的不同而發(fā)生變化。

本研究結果表明，在轉基因玉米各生長時期中，抗蟲Bt蛋白含量均未明顯減少，其抗蟲的表達量趨于穩(wěn)定，能夠持續(xù)地進行抗蟲表達，因此能夠達到更好的抗蟲效果。在玉米不同生長發(fā)育階段的組織中，苗期葉片轉基因蛋白表達量明顯高于心葉期葉片。這可能與表達不同時期的環(huán)境條件有關，也可能與發(fā)育階段中基因的表達調控相互關聯(lián)。

在苗期和心葉期，3種轉化體中，葉片C4-ESS蛋白表達量最高，其中V4葉片時期略大于V8葉片時期，這種情況可能與前期轉化體篩選有關。這一時期葉片的高表達量為草甘膦噴施效果提供了有效保證。3個復合性狀品種的 C4-ESS [2]蛋白均來源于轉基因玉米品種NK603，因此筆者認為，通過雜交育種的復合性狀轉基因轉化體對其親本的安全評價可作為復合性狀雜交種的安全評價的數(shù)據(jù)參考，其外源基因表達可能直接決定親本多種雜交后代中外源基因的表達。

由于NC6304YGRR是在吉林種植和栽培的管理玉米材料，DK007YGRR、DK008YGRR在廣西栽種，因此植株生長的環(huán)境條件有所不同，組織間外源蛋白表達呈現(xiàn)差異。這與文獻中所述轉基因植物外源基因表達與生長自然環(huán)境條件、栽培管理措施密切相關的結論相一致。而在相同條件下栽種的DK007YGRR、DK008YGRR同樣存在表達蛋白量的差異，但差異較小。因此，組織表達與蛋白種類相關性更強，即與轉入的外源基因的本身構建及插入基因組位置有顯著的相關性，該研究結果與其他作物的轉基因外源蛋白表達調控影響的研究[8-9]相一致。有研究表明，雜交本身對于外源基因的表達存在影響[0]，復合性狀玉米與其親本的表達差異和調控，有待于進一步研究。

ELISA方法是直接檢測轉基因植物體內外源蛋白表達量的手段之一，具有快速、簡單、低耗、結果客觀、易判定等特點。本試驗的Bt蛋白和C4-ESS蛋白最低檢出量為05 ng/mL，靈敏度較高。每樣品均作平行檢測，并設立陰性和空白對照，提高了檢測的準確性與可靠性。ELISA方法的檢測也受到檢測環(huán)境溫度、濕度的影響，因此每次檢測要在環(huán)境相同的條件下進行，并且每次均須同時作空白及標準曲線，以減小誤差。穗尖、花絲及花粉的外源蛋白含量比其他部位的含量低，因為這些部分的可溶性蛋白本身含量就低，多為纖維素及其他物質[2]。外源蛋白含量用 g鮮質量中含量表示時，結果受樣品本身含水量的影響較大，導致有一定的誤差。

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