范紫煊，劉紹軍，黃 萱

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

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去皮姜提取物抑制食品大腸菌群的處理條件優(yōu)化

范紫煊，劉紹軍*，黃 萱

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

以pH值、濾紙片浸泡時間、提取物濃度為試驗因素, 采用響應(yīng)面分析法，以抑制大腸菌群的抑菌圈半徑為評價指標，對去皮姜提取物抑制食品大腸菌群的處理條件進行研究。結(jié)果表明，最佳處理條件為：pH值7.0，濾紙片浸泡時間46 min，提取物質(zhì)量濃度310 g/L，實際測得抑菌圈半徑為18.36 mm，與模型預(yù)測值基本相符。

去皮姜；大腸菌群；抑菌效果

隨著人們食品安全意識的加強，人們更加青睞于選擇綠色、天然、安全的食品[1]。生姜及其提取物具有獨特的香氣和辣味,并且可以作為防腐劑、保鮮劑、護色劑，因此，對于生姜提取物的研究有著極高的開發(fā)利用價值和應(yīng)用前景[2，3]。目前，我國食品添加劑種類很多，但都有各自的問題，例如：苯甲酸及其鈉鹽和山梨酸及其鉀鹽的防腐效果受pH值影響[4]；亞硫酸及其鈉鹽會有殘存二氧化硫影響身體健康的問題[5]；乳酸鏈球菌素的抑菌范圍較窄[6]；納他霉素因產(chǎn)量有限，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還是受到限制[7]。因此研發(fā)出更有效的，應(yīng)用范圍廣、人體傷害性低、價格低廉的天然防腐抑菌劑是十分有必要的。對于生姜提取物抑菌方面研究發(fā)現(xiàn)，生姜秸稈提取物有明顯的抑制食品中大腸菌群的作用，每年生姜收獲后,都有大量的生姜秸稈或堆放于路邊、或就地焚燒，不僅給道路交通造成安全隱患，而且由于焚燒生姜秸稈造成的煙霧給環(huán)境造成了嚴重的污染，影響周邊群眾的生活[8]。因此，在pH值、濾紙片浸泡時間及提取物濃度3個單因素實驗的基礎(chǔ)上, 采用響應(yīng)面分析法, 以抑菌圈半徑為評價指標，對生姜秸稈提取物抑制食品大腸菌群的處理條件進行了研究，為開發(fā)生姜秸稈提取物為天然防腐劑提供理論基礎(chǔ)。

響應(yīng)面分析法(Response Surface Method)采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，將多因子試驗中因子與指標的相互關(guān)系用多項式近擬，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并依此從響應(yīng)面的形狀上找到最佳控制點。當曲面形狀復(fù)雜，即在設(shè)計的影響因素的不同水平中無最佳控制點時，還可通過嶺嵴分析，在試驗范圍之外找到最佳控制條件[9]。本次研究在pH值、濾紙片浸泡時間及提取物濃度3個單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，以抑菌圈半徑為評價指標，對去皮姜提取物抑制食品大腸菌群的處理條件進行了研究。

1 實驗材料與方法方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

去皮姜取自撫寧，烘干，過篩(篩孔尺寸：30 mm)，制成去皮姜粉，體積分數(shù)為0.75的乙醇(A.R級),結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)(生化級試劑)。

大腸菌群由河北科技師范學(xué)院微生物實驗室提供。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；DL-1萬用電爐，北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；HC014-11-018-01(X)手提式高壓蒸汽消毒器，上海東亞壓力容器制造有限公司生產(chǎn)；JSP-200型高速多功能粉碎機，浙江省永康市金穗機械制造廠生產(chǎn)；SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；AL104電子天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；V1全自動菌落計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司生產(chǎn)；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 采用索氏提取法提取去皮姜提取物。稱取20 g去皮姜粉用濾紙片包好，放入抽提筒中，在圓底燒瓶中加入體積分數(shù)為0.75的乙醇，使m(去皮姜粉)∶m(乙醇)=1∶12。連接好裝置，將圓底燒瓶放入50 ℃恒溫水浴鍋中，提取3 h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到棕黃色的油狀液體。

1.2.2 抑菌試驗 將直徑10 mm的濾紙片浸泡去皮姜提取物30 min，取濃度為10-5cfu/L的菌懸液，進行抑制食品大腸菌群的測定。使用V1全自動菌落計數(shù)儀拍照并進行對抑菌圈半徑的測定。

1.2.3 單因素試驗 以pH值、濾紙片浸泡時間和提取物質(zhì)量濃度做單因素試驗。①去皮姜提取物的pH值對大腸菌群抑菌作用的影響。稱取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混勻。使用0.1 mol/L HCl溶液、0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整去皮姜提取物pH值至3，5，7，9，11。吸取0.1 mL 10-5cfu/L濃度的大腸菌群菌懸液涂布于VRBA培養(yǎng)基，將直徑10 mm的濾紙片分別浸泡在不同的去皮姜提取物溶液中60 min，取出放在培養(yǎng)基中間，倒置培養(yǎng)24 h。②濾紙片浸泡時間對去皮姜提取物對大腸菌群抑菌作用的影響。稱取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混勻，使其質(zhì)量濃度為1 000 g/L，調(diào)整pH值為7。吸取0.1 mL 10-5cfu/L濃度的大腸菌群菌懸液涂布于VRBA培養(yǎng)基。將直徑10 mm的濾紙片分別浸泡在不同的去皮姜提取物溶液中5，15，30，45，60 min，取出放在培養(yǎng)基中間，倒置培養(yǎng)24 h。③提取物質(zhì)量濃度對去皮姜提取物對大腸菌群抑菌作用的影響。稱取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混勻。梯度稀釋去皮姜質(zhì)量濃度至1 000，500，250，125，62.5 g/L，調(diào)整pH值為7。吸取0.1 mL 10-5cfu/L的大腸菌群菌懸液涂布于VRBA培養(yǎng)基。將直徑10 mm的濾紙片分別浸泡不同質(zhì)量濃度的去皮姜提取物溶液中45 min，取出放在培養(yǎng)基中間，倒置培養(yǎng)24 h。以上實驗測定抑菌圈半徑時，均重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響抑制大腸菌群效果比較顯著的3個因素：pH值、濾紙片浸泡時間和提取物質(zhì)量濃度，采用3因素3水平的Box-Behnken 響應(yīng)面實驗設(shè)計(表1)，共有17個試驗點，其中析因點為12個，中心點為5個。

表1 去皮姜提取物抑制食品大腸菌群的響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計

2 實驗結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 去皮姜提取物的pH值對大腸菌群抑菌作用的影響 當去皮姜提取物pH值為3～7時，對大腸菌群抑菌圈半徑逐漸上升；pH為7時達到最大值；pH值為7～9時，抑菌圈半徑下降(圖1)。偏酸偏堿可能都破壞生姜提取物中的抑菌有效成分，對抑菌效果均有不利影響，故選擇pH 7為去皮姜提取物抑制大腸菌群的最佳值。

2.1.2 濾紙片浸泡時間對去皮姜提取物對大腸菌群抑菌作用的影響 在濾紙片浸泡時間為5～45 min時，去皮姜提取物對大腸菌群抑菌效果隨浸泡時間增加而升高(圖2)，這是由于生姜提取物中的抑菌有效成分滲入到了濾紙片中，當浸泡時間為45 min時，有效成分滲透完全，抑菌圈半徑達到最大值，超過45 min后，有效成分飽和后隨時間增加而流失一部分，因此效果下降，故選擇45 min為最佳濾紙片浸泡時間。

圖1 去皮姜提取物pH值對大腸菌群抑菌作用的影響 圖2 濾紙片浸泡時間對大腸菌群抑菌作用的影響

2.1.3 去皮姜提取物質(zhì)量濃度對大腸菌群抑菌作用的影響 在去皮姜提取物質(zhì)量濃度為1 000～250 g/L時，抑菌圈半徑呈上升趨勢；在質(zhì)量濃度為250～62.5 g/L時，抑菌圈半徑呈下降趨勢；在去皮姜提

圖3 去皮姜提取物質(zhì)量濃度對大腸菌群抑菌作用的影響

取物質(zhì)量濃度為250 g/L時達到最大值，抑菌效果最佳(圖3)。這可能是生姜提取物在低濃度下有效成分不夠，不足以破壞食品大腸菌群的結(jié)構(gòu)，當濃度過高時又抑制了有效成分的抑菌作用，故選擇250 g/L為去皮姜提取物抑制大腸菌群的最佳質(zhì)量濃度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化去皮姜提取物抑制大腸菌群的條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響抑制大腸菌群效果比較顯著的3個因素：pH值、濾紙片浸泡時間和提取物質(zhì)量濃度，采用3因素3水平的Box-Behnken 響應(yīng)面實驗設(shè)計，共有17 個試驗點，其中析因點為 12 個，中心點為 5 個。實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化去皮姜提取物抑制大腸菌群的實驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)表2中的實驗數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.0.5軟件對其進行二次回歸擬合，得到的抑菌圈半徑R1對pH值(A)、濾紙片浸泡時間(B)、去皮姜提取物質(zhì)量濃度(C)的回歸方程為:

R1=18.87+0.43A+0.69B-0.22C+1.42AB-0.99AC-0.39BC-7.37A2-5.17B2-6.16C2

方程回歸分析及方差分析結(jié)果表明：pH值的二次項、濾紙片浸泡時間的二次項和提取物濃度的二次項均有極顯著影響(表3)。試驗中選用的模型P值<0.001具有極顯著性，失擬項為0.201 5，<0.050 0，表明失擬不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.976 5，表明該模型擬合程度良好，可用于優(yōu)選去皮姜提取物抑制大腸菌群處理條件的理論預(yù)測。

表3 回歸系數(shù)顯著性分析

注：***P<0.001為極顯著，**P<0.01為非常顯著，*P<0.05為顯著。

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)面曲線，能得到兩個因素交互作用對響應(yīng)值(抑菌圈半徑Y(jié))的影響，結(jié)果見圖4～圖6。比較圖4～圖6與回歸方程各項方差可以看出，各因素對抑菌圈半徑的影響由大到小依次為：pH值(A)，提取物濃度(C)，濾紙片浸泡時間(B)；在3個因素中，濾紙片浸泡時間與pH值對響應(yīng)值的影響曲線較陡，說明濾紙片浸泡時間與pH值交互作用對抑菌圈半徑具有影響。

圖4 pH值與濾紙片浸泡時間交互作用等高圖及3D效果圖

圖5 pH值與去皮姜提取物質(zhì)量濃度交互作用等高圖及3D效果圖

圖6 濾紙片浸泡時間與提取物質(zhì)量濃度交互作用等高圖及3D效果圖

2.4 驗證試驗

采用Design-Expert 8.0.5 軟件對方程中的R1進行求解，得到去皮姜提取物處理理論最佳工藝的條件為：pH 7.08，濾紙片浸泡時間46.09 min，去皮姜提取物質(zhì)量濃度310 g/L，在此條件下預(yù)測抑菌圈半徑可達18.903 6 mm。根據(jù)實際操作將最佳條件修改為：采用pH 7.0，濾紙片浸泡時間46 min，去皮姜提取物質(zhì)量濃度310 g/L，對去皮姜提取物進行3次平行驗證試驗，實際測得抑菌圈半徑平均值為18.36 mm，達到理論值的97.1%。試驗結(jié)果表明，預(yù)測值與實際值的偏差較小，試驗優(yōu)化的參數(shù)準確可靠。

4 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計,以pH值、濾紙片浸泡時間、提取物質(zhì)量濃度為試驗因素，以抑制大腸菌群的抑菌圈半徑為指標,得到數(shù)學(xué)回歸模型，采用Design-Expert 8.0.5軟件對方程進行求解，以及綜合情況考慮，得到響應(yīng)面法優(yōu)化去皮姜提取物抑制大腸菌群的理論最佳處理條件為：pH 7.0，濾紙片浸泡時間46 min，去皮姜提取物質(zhì)量濃度為310 g/L，測得去皮姜提取物抑制食品中大腸菌群的抑菌圈半徑為18.36 mm。經(jīng)過驗證預(yù)測值與實際值的偏差較小，試驗優(yōu)化的參數(shù)準確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

[1] 李大峰,賈冬英,姚開,等.生姜及其提取物在食品加工中的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品,2011(2):36.

[2] 范紫煊，劉紹軍，武云松.生姜精油提取及對大腸菌群的抑菌作用[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2014，28(3)：34-39.

[3] 趙德安.思維方式與傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)工藝[J].中國調(diào)味品,2011,36(2):17-19.

[4] 曾正渝.苯甲酸及其鈉鹽在食品和藥品中的應(yīng)用[J].中國藥業(yè),2007,16(6):64.

[5] 陳玉梅.亞硫酸鹽類在食品中的應(yīng)用及殘留控制[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2010,20(3):22-24.

[6] 王麗,張毓,陳翠嵐.我國食品防腐劑的應(yīng)用及發(fā)展趨勢[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2011,2(2):83-87.

[7] 刁益韶,賈萌,朱璐瑤.食品防腐劑的使用現(xiàn)狀及安全性分析[J].河北化工, 2012, 35 (10):63-66.

[8] 閆永亮,張秀云.生姜秸稈栽培杏鮑菇培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].北方園藝,2014(7):140-143.

[9] 王振宇,周芳,趙鑫.響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取大果沙棘總黃酮工藝[J].中國食品學(xué)報,2007,7(6):44-51.

(責任編輯：朱寶昌)

Optimization of Processing Condition of Peeled Ginger Extract Inhibiting Coliform Bacteria in Food

FAN Zi-xuan，LIU Shao-jun，HUANG Xuan

(College of Food Science & Technology,Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei，066600,China)

Using the response surface analysis and taking the bacteriostatic ring radius of inhabiting coliform bacteria as the evaluation index, the peeled ginger extract inhibiting coliform bacteria in food processing conditions were studied with pH value, filter, soaking time, the concentration of the extract as the test factors. The results showed that the optimum processing conditions is: the pH value 7.0, filter soak time 46 min, concentration of the extract 310 g/L, the actual measured bacteriostatic ring radius 18.36 mm, that are essentially the same with the model prediction.

peeled ginger; coliform bacteria; bacteriostatic effect

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.005

范紫煊(1991-),女,在讀碩士研究生。主要研究方向：食品加工與安全。

河北省科技支撐計劃項目(項目編號：11221002D)。

2015-03-17

S632.5

A

1672-7983(2015)01-0023-06

*通訊作者，男，碩士,教授。主要研究方向：食品加工與安全。E-mail：spxykj@126.com。