莫國棟 楊 瑾 周再生 宋鳳蘭 曾維國 李嘉良

1.廣東省中山市第二人民醫(yī)院藥劑科，廣東中山 528447；2.廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山 528400

據(jù)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會不完全統(tǒng)計(jì)，我國目前乙型肝炎病毒攜帶者已達(dá)1 億多人。 其中，絕大多數(shù)乙型肝炎、 丙型肝炎患者會發(fā)展成慢性肝病，目前針對此類疾病治療方法不少，中西藥治療兼具。 文獻(xiàn)報(bào)道的中成藥，又存在配方參差不齊、藥味眾多、組方龐雜、使用不方便、服藥禁忌及毒副作用不明等不足，故研究高效、使用方便的中藥顆粒制劑是臨床醫(yī)療的迫切需要。

柴苓護(hù)肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參等八味中藥組成的醫(yī)院特色制劑之一。 方中柴胡具有疏肝解郁，使肝氣條達(dá)的功效[1]。王占一等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡提取物對肝臟起到一定的疏肝作用。鄭純威等[4]發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷能降低病理模型的死亡率，在一定程度上可改善肝功能的相應(yīng)指標(biāo)。 黨參的主要藥理作用是補(bǔ)血作用、對胃腸道的調(diào)節(jié)作用[5]、急性肝損傷保護(hù)作用等。諸藥合用[6-10]，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效，臨床多應(yīng)用于酒精性肝病，也有報(bào)道其對非酒精性脂肪性肝病有很好的治療作用。本研究擬采用傳統(tǒng)老中醫(yī)中藥處方與現(xiàn)代顆粒制劑技術(shù)結(jié)合的方法，研制出高效且使用方便的新藥。 豬苓多糖、黨參多糖等成分具有明顯的保肝作用，因此本文以總多糖含量作為考察指標(biāo)，對水提工藝進(jìn)行優(yōu)選，以確定最佳水提工藝，為日后生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)[UV-1800，島津儀器（蘇州）有限公司]；十萬分之一電子天平（AUW220D，Shimadzu）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52C，上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（B-220，上海亞榮生化儀器廠）；AS 系列超聲波清洗機(jī)（AS20500A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；AP-01P 真空泵（AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；濃縮鍋（06038，湖南衡陽金一帆制藥設(shè)備實(shí)業(yè)有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（10-2A，上海滬越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司、滬越科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-000911）， 甲醇（廣州市東江化工廠， 批號：2012071102），苯酚（廣州洛辛寶化學(xué)試劑有限公司），濃硫酸（廣州市東紅化工廠，批號：2011080919），磷酸（廣州市東紅化工廠，批號：2011110702），活性碳，對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液，氨水甲醇。

柴胡、豬苓、黨參等八味藥材購于廣州致信藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平的選擇

通過前期查閱文獻(xiàn)，柴苓護(hù)肝顆粒的工藝研究選擇煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水倍數(shù)、醇沉濃度為考察因素，以方中總多糖的含量測定結(jié)果采用正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝。 實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

2.3.4 檢測波長的選擇 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各2 mL，按上述顯色方法，在波長300～600 nm范圍內(nèi)檢測。結(jié)果顯示，供試品溶液、對照品溶液的紫外吸收光譜最大吸收波長均為490 nm，故選用490 nm作為最佳檢測波長。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取1、2、3、4、6 mL 對照品溶液置于10 mL 容量瓶中， 用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。 按上述顯色方法操作，在490 nm 波長處測定吸光度。以吸光度值（A）對葡萄糖濃度（C）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.0142C＋0.0044（r=0.9998，n=5），線性范圍為10.01～60.06 μg/mL，表明在此范圍內(nèi)， 葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。見圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平

圖1 葡萄糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 正交試驗(yàn)濃縮液的制備

取柴胡、豬苓、黨參等八味藥材共90 g，按“2.1”項(xiàng)下正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，合并提取液，濾過，濾液濃縮并定容至100 mL，備用。

2.3 總多糖含量測定

以葡萄糖為對照品， 采用苯酚-硫酸顯色法測定提取液中總多糖的含量。

2.3.1 對照品溶液的制備 將105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品，精密稱取0.1001 g，置于100 mL 容量瓶中，蒸餾水將其溶解并稀釋至刻度，搖勻。 精密吸取5 mL置于50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，得0.1001 mg/mL的溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下濃縮液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，加入0.3%的活性炭，脫色30 min，濾過，精密量取續(xù)濾液0.2 mL， 置于10 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容，得0.1396 mg/mL 的供試品溶液。

2.3.3 顯色方法 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各2 mL，至具塞試管中，另量取2 mL 蒸餾水作為空白，各試管加入1.0 mL 的5%苯酚試液，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，即得。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取同一葡萄糖對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法操作，于490 nm 處連續(xù)測定吸光度6 次，結(jié)果RSD 值為0.19%（n=6），表明儀器的精密度良好。 見表2。

表2 供試品溶液的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取相同的6 份供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法操作，進(jìn)行測定，計(jì)算總多糖含量，結(jié)果RSD 為1.3%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。 見表3。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.5 mL，共9 份， 分別準(zhǔn)確加入葡萄糖對照品55.05、100.1、150.15 mg（每個(gè)濃度3 份），按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備和“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法操作，測定吸光度，平均回收率為98.95%，RSD 為1.1%（n=9）。 見表4。

表3 供試品溶液的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法操作，室溫放置，分別于0、15、30、45、60、90 min測定吸光度，結(jié)果RSD 為1.6%（n=6），表明樣品溶液在90 min 內(nèi)穩(wěn)定。 見表5。

表5 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10 正交試驗(yàn)總多糖含量測定 精密吸取供試品溶液1 mL，按照上述顯色方法顯色，測定其總多糖的含量。 見表6。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)根據(jù)“2.1”項(xiàng)下正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對柴苓護(hù)肝顆粒進(jìn)行水提工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響提取效率的因素依次為A ＞D ＞C ＞B，最佳工藝條件為A3B3C2D1，煎煮時(shí)間對提取效率影響最小，煎煮次數(shù)、加水量、醇沉濃度對提取效率沒有顯著性影響。 為了縮短提取周期，節(jié)約能源，結(jié)合大生產(chǎn)實(shí)際，將最終工藝確定為加10 倍量水， 提取3 次， 每次提取2 h， 醇沉濃度為50%。

表6 正交試驗(yàn)總多糖含量測定

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 方差分析表

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量稱取3 份藥材適量，按“2.4”項(xiàng)下優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，并測定總多糖的含量。結(jié)果表明，優(yōu)選工藝可行、穩(wěn)定，可用于科研“柴苓護(hù)肝顆?！钡奶崛」に?。 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表9，總多糖含量平均值為177.5 mg/mL， 說明該提取工藝條件基本穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。

2.6 成型工藝的篩選

2.6.1 輔料的篩選 單獨(dú)的浸膏很難制成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)合格的顆粒，為了使顆粒具有相對較小的吸濕性以及相對較好的流動性，特對制粒輔料進(jìn)行篩選，選擇無水葡萄糖、糖粉、乳糖、糊精、甘露醇5 種輔料作為被選賦形劑，稱取一定量的濃縮浸膏（相對密度約為1.30，50℃）和等量的不同賦形劑，分別進(jìn)行濕法制粒。 由表10 可知，甘露醇是可溶性顆粒的優(yōu)良賦形劑，且不含糖，可制備無糖顆粒，但無黏合性，顆粒易松散，而糊精作為賦形劑，有一定的黏合性，但較硬結(jié)，乳糖和葡萄糖制備的顆粒性狀較好，同時(shí)考慮到人體排解代謝酒精的過程，需消耗大量糖元，葡萄糖能及時(shí)有效地補(bǔ)充人體所需糖分、加速酒精的代謝和排毒，故選擇葡萄糖為最優(yōu)賦形劑。

表9 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表10 賦形劑的篩選

2.6.2 顆粒的制備 稱取處方量藥材，按最佳提取工藝即加10 倍水，浸泡0.5 h，煎煮3 次，2 h/次，醇沉濃度為50%，藥液濃縮至相對密度約為1.30（50℃）的浸膏，加入4 倍量的葡萄糖粉，制軟材，過12 目篩濕法制粒，60℃干燥2 h，整粒，即得。

3 討論

柴苓護(hù)肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參等八味中藥組成，諸藥合用，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效。 臨床用于各種慢性肝炎，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、慢性病毒性肝炎等。迄今為止，已從柴胡中分離鑒定出多種化合物及有效成分， 其中包括多糖類成分、幾十種皂苷類化合物及幾百種揮發(fā)油類化合物等。柴胡水提取物和醇提取物均具有一定的疏肝解郁，使肝氣條達(dá)的功效。 對黨參成分研究的報(bào)道較多，主要有多糖類、甾醇類、生物堿類、倍半萜內(nèi)酯類成分等。 多糖類、氨基酸類、維生素類、微量無機(jī)元素類、甾體類及非甾體類（除多糖類外）等多種豬苓的化學(xué)成分均已報(bào)道，其具有利尿、抗癌和抗菌的作用，利水滲濕是其主要功能。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多糖具有明顯的抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫等作用[11-12]，對腫瘤、肝炎、心血管病、糖代謝調(diào)節(jié)和抗衰老等疾病的預(yù)防和治療，發(fā)揮重要的作用[13-14]。 柴苓護(hù)肝顆粒的制備工藝路線根據(jù)臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和處方藥材有效成分的性質(zhì)，以總多糖含量為考察指標(biāo)，采用水提醇沉路線制備。 采用單因素正交試驗(yàn)，對煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量、醇沉濃度等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳提取工藝，以顆粒中的總多糖含量為指標(biāo)，最終確定其工藝路線如下：按處方量稱取柴胡、豬苓、黨參等八味藥材，加10 倍量水，煎煮3次，2 h/次，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.18～1.20（50℃）的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量為50%，攪勻，靜置24 h，取上清液濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.28～1.30（50℃）的稠膏，加入葡萄糖粉適量，制成顆粒，干燥，分裝，質(zhì)檢。 通過中試，柴苓護(hù)肝顆粒各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到預(yù)定要求，表明所選工藝合理、可行，可為生產(chǎn)提高理論依據(jù)和相應(yīng)的工藝參數(shù)。

現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有保肝、抗炎、抗病毒、解熱、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性作用[15-18]。方中其他藥物如黨參也含皂苷類成分。干膏得率作為劑型選擇的參考指標(biāo)，是確定顆粒劑藥物日服量、單服量及包裝規(guī)格的重要參數(shù)[19-22]。 因此，皂苷、干膏得率也可作為考察的指標(biāo)，為日后建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做準(zhǔn)備。 但是目前總多糖含量測定數(shù)據(jù)不理想，所以筆者將總多糖含量的測定作為后期工藝進(jìn)一步優(yōu)化的工作重點(diǎn)。

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