謝貴林 陳璐艷 陳新華 溫 浩 陳新梅

1.浙江省紹興第二醫(yī)院普外科，浙江紹興 312000；2.浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，浙江杭州 310000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，新疆烏魯木齊 830054；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355

乳腺癌成為威脅女性的重大健康問題[1]。 根據(jù)我國2014 年腫瘤年報(bào)， 乳腺癌發(fā)病率和病死率持續(xù)增高[2]。MDA-MB-231 可以用于制作研究高侵襲乳癌細(xì)胞的細(xì)胞模型和動物模型[3]。目前多學(xué)科聯(lián)合治療是乳腺癌的主要方法[4]。根據(jù)目前消融介入技術(shù)的發(fā)展，微創(chuàng)消融也逐漸進(jìn)入乳腺癌的綜合治療計(jì)劃中。脈沖場強(qiáng)可以引起電穿孔[5]，電穿孔不僅提高細(xì)胞膜對化療藥物的滲透率，增強(qiáng)化療藥物細(xì)胞毒性，還能通過降低化療藥物的使用劑量從而減小對正常細(xì)胞的毒副作用。而納秒脈沖是不同于電穿孔技術(shù)的最新一代電脈沖消融技術(shù)。 納秒脈沖引起細(xì)胞膜的微孔出現(xiàn)，最終形成細(xì)胞凋亡[6-7]。避免了嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[8]，凋亡最初是在胚胎[9]及免疫系統(tǒng)[10]發(fā)育中發(fā)現(xiàn)。 而在腫瘤治療中凋亡產(chǎn)生則意味著腫瘤被消滅而機(jī)體未被傷害。Caspase 是凋亡發(fā)生的一個(gè)重要分子標(biāo)志[11-13]，在本實(shí)驗(yàn)中納秒級脈單獨(dú)治療腫瘤，避免了化療副作用。

納秒脈沖在美國已經(jīng)開展皮膚基底細(xì)胞癌的臨床前期試驗(yàn)，在政府網(wǎng)站上可見其登記號碼Clinicaltrials.gov ID：NCT01463709）。 脈沖治療儀器已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，AngioDynamics 公司已將該治療儀用于首例早期肝臟腫瘤的治療中，它可以在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)抑制新生血管的形成，從而防止腫瘤的復(fù)發(fā)[14]。 納秒脈沖的波長要遠(yuǎn)小于微妙脈沖，是一種非熱生物效應(yīng)及非藥物依賴性治療方法， 具有良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察nsPEFs 對于乳腺癌細(xì)胞的消融效果，對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及抗體

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院多器官聯(lián)合移植實(shí)驗(yàn)室提供，含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中37℃，5%CO2下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 nsPEFs 治療

納秒脈沖發(fā)生器由杭州睿笛生物科技有限公司制造NANOABLATION 腫瘤消融儀器。 2.5×106個(gè)細(xì)胞放置于電極杯中治療。治療后的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育1 h 后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞活性

細(xì)胞活性由Cell Counting Kit 檢測， 用黃色吸光度值反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化

采用100 個(gè)脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強(qiáng)的納秒脈沖對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行電擊， 其中0 kV/cm 為對照組，余為實(shí)驗(yàn)組。所有經(jīng)過電擊治療的細(xì)胞孵育1 h 后，收集細(xì)胞，通過碘化丙啶（PI）染色法檢測細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未作任何處理的空白對照。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

采用100 個(gè)脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強(qiáng)的納秒脈沖對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行電擊，所有經(jīng)過電擊治療的細(xì)胞孵育1 h 后，收集細(xì)胞，通過PI 染色法檢測細(xì)胞凋亡，并且第一組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。 本實(shí)驗(yàn)電鏡標(biāo)本送往南京軍區(qū)總醫(yī)院病理科檢測，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

采用100 個(gè)脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強(qiáng)的納秒脈沖對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行電擊，所有經(jīng)過電擊治療的細(xì)胞孵育1 h 后，收集細(xì)胞，戊二醛固定，送往南京軍區(qū)總醫(yī)院病理科通過透射電鏡結(jié)果觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7 JC-1 實(shí)驗(yàn)檢測線粒膜電位變化

經(jīng)過電擊的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。 用BD 公司線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）進(jìn)行檢查。 用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志。

1.8 動物模型的制作

本實(shí)驗(yàn)使用的是C57B16 小鼠乳腺癌荷瘤模型，接種腫瘤細(xì)胞后連續(xù)測量腫瘤生長及長寬高3 個(gè)參數(shù)， 并且在第0、1、2 天分別給予300 ns，40 kV/cm，100 個(gè)脈沖的電擊，然后進(jìn)行體積的比較。

圖1 乳腺癌小鼠模型的制作及其B 超

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用CCK-8 法檢測經(jīng)nsPEFs 處理后的細(xì)胞活性

不同場強(qiáng)（0、20、40、60 kv/cm）的nsPEFs 作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 后， 細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h 和72 h，然后使用CCK-8 檢測細(xì)胞活性。結(jié)果表明：隨著脈沖場強(qiáng)的增加，細(xì)胞活性明顯降低，且與對照組比較（0 kV/cm），20、40、60 kV/cm 各場強(qiáng)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的活性（P ＜0.01），各實(shí)驗(yàn)組組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）（圖2），其中40 kV/cm能達(dá)到最大抑制率被定為最佳治療參數(shù)， 增高場強(qiáng)到60 kV/cm 后不能再進(jìn)一步提高抑制率；同一場強(qiáng)作用于細(xì)胞后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞活性也明顯降低。

圖2 不同場強(qiáng)的納秒脈沖對乳腺癌細(xì)胞的抑制情況

2.2 采用流式細(xì)胞檢測經(jīng)nsPEFs 處理后細(xì)胞早期凋亡情況

在100 個(gè)脈沖，300 ns 條件下，與0 kV/cm 組比較，細(xì)胞的早期凋亡率在20 kV/cm 的場強(qiáng)時(shí)明顯升高（P ＜0.01），在40 kV/cm 和60 kV/cm 時(shí)呈逐漸降低趨勢。 相反， 細(xì)胞的壞死率隨著場強(qiáng)的增加（0、20、40、60 kV/cm），呈持續(xù)性升高趨勢，且為劑量依賴性（P ＜0.01）（圖3）。 結(jié)果表明，伴隨著納秒脈沖電場的強(qiáng)度增加，脈沖誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要表現(xiàn)為從早期凋亡至晚期凋亡或細(xì)胞壞死，呈劑量依賴性。

2.3 采用流式細(xì)胞檢測經(jīng)nsPEFs 處理后細(xì)胞周期的改變

經(jīng)過納秒脈沖（300ns，100 個(gè)脈沖，0、20、40、60kV/cm）治療后，M 期的細(xì)胞明顯減少，由于M 期可以反映細(xì)胞增殖的能力， 因此可以說明細(xì)胞增殖被明顯抑制，但是此結(jié)果在各電場強(qiáng)度之間差異不明顯，說明不具有劑量依賴性。 見圖4。

圖3 不同強(qiáng)度納秒脈沖治療后細(xì)胞凋亡情況

2.4 透射電鏡（TEM）觀察乳腺癌細(xì)胞經(jīng)納秒脈沖電擊后凋亡情況

在對照組中（0 kV/cm），幾乎未見到凋亡細(xì)胞。隨著劑量增高，乳腺癌細(xì)胞開始出現(xiàn)早期凋亡；升高到40 kV/cm 時(shí)，出現(xiàn)變性改變；而60 kV/cm 則引起細(xì)胞壞死。 見圖5。

2.5 JC-1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 不同場強(qiáng)的納秒脈沖治療后細(xì)胞周期的改變

圖5 不同場強(qiáng)的納秒脈沖治療后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

脈沖治療后，細(xì)胞沒有遷移，提示JC-1 單體穩(wěn)定存在。 60 kV/cm 條件下增加脈沖個(gè)數(shù)，導(dǎo)致JC-1 分布遷移，凋亡細(xì)胞增多，脈沖個(gè)數(shù)由2 個(gè)增加至5 個(gè)后遷移程度最大。 提示納秒脈沖增多，能夠引起細(xì)胞線粒體膜電位下降。 見圖6。

圖6 60 kV/cm 納秒脈沖治療后細(xì)胞線粒體膜電位下降情況

2.6 納秒脈沖對C57B16 小鼠腫瘤的治療消融

在C57B16 小鼠實(shí)驗(yàn)上，接種人乳腺癌細(xì)胞后對照組腫瘤隨著時(shí)間的增加而明顯增大。 經(jīng)過連續(xù)3 d電擊治療后的實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤與對照組比較生長明顯減慢，腫瘤未出現(xiàn)再次生長或復(fù)發(fā)。 見圖7～8。

3 討論

圖7 各組腫瘤大小對比情況

圖8 不同時(shí)間各組小鼠乳腺腫瘤大小變化情況

乳腺癌在全球范圍內(nèi)仍然是導(dǎo)致女性死亡的重要原因之一[16]。 乳腺癌是一種全身性疾病的理念已被廣泛接受，合理的綜合治療是獲得乳腺癌長期生存的重要手段。 目前其主要治療方法有手術(shù)、放療和化療等。 納秒脈沖是脈沖電場技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，它將脈寬降到納秒級以下的同時(shí)提高場強(qiáng) （＞10 kV/cm）[17]，它不會引起明顯的電穿孔現(xiàn)象[18]， 但是細(xì)胞出現(xiàn)微孔，形成凋亡，與化療及放療比較，納秒脈沖是一可以局部使用且不產(chǎn)熱的消融手段。其作用的效果根據(jù)脈沖的個(gè)數(shù)，脈寬以及場強(qiáng)等因素決定。 不同類型的細(xì)胞[19-20]以及不同的細(xì)胞周期[21]對于納秒脈沖的敏感性均不相同。

首先選擇的參數(shù)是100 個(gè)脈沖，300 ns 脈寬，場強(qiáng)為0、20、40、60 kV/cm 的4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組， 這個(gè)參數(shù)設(shè)置是根據(jù)皮膚黑色素瘤治療中確認(rèn)的有效參數(shù)，在本次實(shí)驗(yàn)中，CCK-8 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)皮膚腫瘤治療參數(shù)在乳腺癌中也有效，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)納秒脈沖在抑制細(xì)胞活性，阻斷細(xì)胞于M 期，減少細(xì)胞增長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡上具有顯著的效果。 在最高的電場強(qiáng)作用下（60 kV/cm），并沒有觀察到細(xì)胞質(zhì)膜的破裂和壞死，所以細(xì)胞的死亡至少在某一程度上是程序性的[21-22]而且，納秒脈沖還能有效地重排細(xì)胞骨架蛋白[23]以及導(dǎo)致DNA 斷裂[24-25]。 本實(shí)驗(yàn)對量效關(guān)系進(jìn)行了考察，如果納秒脈沖應(yīng)用于臨床，40 kV/cm 場強(qiáng)可以作為一個(gè)參考的參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面，從細(xì)胞的凋亡及線粒體膜電位改變等方面來觀察納秒脈沖作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 后的效果。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納秒脈沖對于人乳腺癌細(xì)胞具有較為顯著的治療作用， 但治療參數(shù)的選擇是決定消融效果的重要因素，治療劑量并非越高越好，過強(qiáng)過多的治療會引起細(xì)胞完全壞死， 而在達(dá)到一定參數(shù)時(shí)例如40 kV/cm是對本實(shí)驗(yàn)接種的荷瘤小鼠的最佳治療參數(shù)。 本實(shí)驗(yàn)的局限是未對細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的分子事件進(jìn)行進(jìn)一步追蹤[26-28]。 尤其是NF-κB 信號通路需要進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)等證實(shí)了納秒脈沖可以誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的凋亡， 可能是通過激活Caspase 信號通路，是一種有效的治療乳腺癌的方法。

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