徐 滌, 曹曉菲, 張曉舟, 張學成

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，海洋生命學院，山東 青島 266003)

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缺氮培養(yǎng)條件對膠球藻C-169油脂積累
及其脂肪酸組成的影響?

徐 滌, 曹曉菲, 張曉舟, 張學成

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，海洋生命學院，山東 青島 266003)

隨著石油資源短缺的加劇，利用微藻生產(chǎn)生物柴油獲得了全世界范圍的關(guān)注，其中篩選高含油藻種是微藻能源產(chǎn)業(yè)的基本環(huán)節(jié)。本文研究了缺氮培養(yǎng)對膠球藻C-169在生長速率、油脂含量以及脂肪酸組成等方面的影響，結(jié)果顯示，氮缺乏條件下，C-169從第3天開始生長速率明顯低于正常培養(yǎng)組，10 d后細胞密度維持在大約1.6×107cells/mL，為初始細胞密度的約33倍。而根據(jù)尼羅紅熒光顯微觀察其在培養(yǎng)的第12天油脂積累達到最高，此時總脂中脂肪酸的含量由開始的0.089ng/1 000cells增長到1.135ng/1 000 cells，而三酰甘油(TAG)占總脂比例達到的74.6%，其中以C16或C18飽和或單不飽和脂肪酸為主，其中油酸(18:1)的量占據(jù)了中性脂TAG的一半以上，符合生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油的要求。關(guān)鍵詞：膠球藻C-169；缺氮；油脂積累；脂肪酸組成

隨著石化柴油資源短缺問題的日益加劇，能源問題已成為世界各國共同關(guān)注的焦點，開發(fā)可再生的和清潔的能源成為當今世界的研究熱點[1-2]。生物柴油作為具有優(yōu)良的環(huán)保性、潤滑性、低溫起動性及可再生性的清潔能源，因其優(yōu)越的性能引起了世界范圍內(nèi)的高度關(guān)注[3-4]。

微藻種類繁多、分布廣，可直接利用陽光、CO2及N、P 等簡單營養(yǎng)物質(zhì)快速生長并在胞內(nèi)合成大量油脂 (主要是甘油三酯)，并可用非農(nóng)林業(yè)耕地和水源大規(guī)模培養(yǎng)，因而受到廣泛重視[5-7]。很早研究者就發(fā)現(xiàn)微藻產(chǎn)生的油脂通過酯化反應后可轉(zhuǎn)變?yōu)樯锊裼?，利用微藻產(chǎn)油在技術(shù)上可行，然而到目前為止高成本仍然是制約微藻能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[6,8-9]，產(chǎn)業(yè)化開發(fā)缺乏堅實的理論基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)支撐[10]，因此持續(xù)選育高油藻株，深入研究其油脂代謝途徑及其調(diào)控等都是目前所亟需的。

膠球藻(Coccomyxasp.)C-169是一種非運動型的單細胞綠藻，屬于綠藻門，共球藻綱(Trebouxiophyceae)，與小球藻(Chlorella)親緣關(guān)系接近。實際上C-169最初被劃歸于小球藻屬，后來才確立為膠球藻。該藻于1959 年首次從南極的地衣中分離獲得[11]，是適應極端環(huán)境的一個代表物種[12-13]，也是第一個完成基因組測序的極地真核藻種[14]。

微藻細胞在適宜的生長條件下其脂肪酸主要用于合成膜脂等結(jié)構(gòu)脂類，而在環(huán)境脅迫下，尤其是營養(yǎng)鹽的缺乏等則會導致其用于合成高能的儲存物質(zhì)，如三酰甘油(triacylglycerol, TAG)等[15-17]。許多研究表明，培養(yǎng)基中的氮濃度是影響微藻生化成分的最主要因素，因此缺氮培養(yǎng)經(jīng)常用于誘導提高微藻的油脂含量[16,18-21]。研究還發(fā)現(xiàn)在光合自養(yǎng)時補充CO2可以顯著提高C-169的生物量或者油脂積累，而且其細胞壁薄而易于酶解，這些特性使C-169的藻油易于提取[22]。

本文研究了進行光合自養(yǎng)的膠球藻C-169在缺氮條件下的生長和油脂積累情況，分析其油脂的脂肪酸組成和含量的變化，探討C-169作為能源微藻藻種的可行性。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)

膠球藻Coccomyxasp. C-169由本實驗室保存。培養(yǎng)基為Bold’s basal(BBM)培養(yǎng)基[23]。實驗所采用的培養(yǎng)條件為光照振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(23±1)℃，振蕩速率為200 r/min，光照強度為180 μmol·m-2·s-1，光周期為12 L/12 D。

1.2 缺氮培養(yǎng)對C-169生長的影響

將Coccomyxasp. C-169預培養(yǎng)至對數(shù)生長中期后，離心收集藻細胞(3 500r/min，5min)，分別以正常的BBM培養(yǎng)基(BBM+N)和氮源缺失的BBM培養(yǎng)基(BBM-N)重懸，使初始藻細胞密度都約為0.5×106cells/mL，同上培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12d，每組設(shè)置3個平行樣。每天取樣以血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算藻液濃度繪制生長曲線。

1.3 尼羅紅染色顯微觀察缺氮培養(yǎng)對C-169油脂積累的影響

同上方法分別以BBM+N培養(yǎng)基和BBM-N培養(yǎng)基重懸處于對數(shù)生長中期的藻細胞，使其初始密度約為0.5×106cells/mL，培養(yǎng)12d，每組設(shè)置3個平行樣。其中根據(jù)預實驗結(jié)果，正常BBM培養(yǎng)基培養(yǎng)至第6天后也會有輕微的油滴積累，因此在第6天時將BBM+N組更新培養(yǎng)基。

每天定時取樣進行尼羅紅(Nile Red)染色觀察[24-25]：每個樣品的藻細胞數(shù)為(1～3)×106cells，離心收集后重懸在370μL BBM培養(yǎng)基中，加入125μL DMSO和1μL尼羅紅儲存液(1mg尼羅紅粉末溶解于4mL DMSO中)，37℃溫浴15min后用熒光顯微鏡進行觀察(Olympus，F(xiàn)V500)，激發(fā)光波長443nm，油鏡下利用560～590nm帶通濾波進行尼羅紅熒光的觀察。整個過程要以鋁箔包裹以避光。

1.4 藻細胞的油脂和脂肪酸分析

同上方法分別以BBM+N培養(yǎng)基和BBM-N培養(yǎng)基重懸處于對數(shù)生長中期的藻細胞，使其初始密度約為2×107cells/mL，培養(yǎng)12d，每組設(shè)置3個平行樣，根據(jù)尼羅紅染色對C-169油滴積累的觀察結(jié)果，將油脂分析的取樣時間定為第4、5、6、11和12天，培養(yǎng)基進行重懸時的藻細胞樣品作為對照(第0天)，整個實驗重復2次。

使用螺口玻璃管(13×100mm)離心收集約～ 1.5×108個藻細胞，抽吸去除培養(yǎng)基后，加入 300μg的十七烷酸甘油三酯(C17∶0)(儲存液為濃度10mg/mL的甲苯溶液)作為內(nèi)標。

總脂的提取按照Bligh 和 Dyer[26]的方法：將3 mL含0.01%(w/v)二丁基羥基甲苯的甲醇∶氯仿(2∶1，v/v)加入到藻細胞后25 ℃溫育30min，加入1mL氯仿和1.8mL水，劇烈震蕩混勻，離心1000×g后棄去上層相，將含有油脂的下層有機相轉(zhuǎn)移到新的玻璃管中。提取的油脂在氮氣氣流中干燥后重懸于0.5mL 氯仿∶甲醇(6∶1, v/v)中。該提取物的1/4將被用于總脂肪酸成分分析，其余用于TAG分析。

藻細胞總脂的脂肪酸含量和組分檢測根據(jù)Cahoon 等[27]的方法，將脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(FAMEs)后采用 GC-FID (氣相色譜-氫火焰離子化檢測法)進行定量分析，具體如下：取125μL上述提取物轉(zhuǎn)移至新的螺口玻璃管中，氮氣干燥后重懸于250μL甲苯和1 mL硫酸甲醇溶液(2.5%, v/v)中，通氮氣條件下加蓋，90℃加熱30min；冷卻過程中加入0.5 mL H2O和0.7mL庚烷，劇烈振蕩后離心，上層相為庚烷層，含有FAMEs；使用配備Agilent INNOWax 層析柱 (內(nèi)徑0.25cm，長30cm)的Agilent 7890氣相色譜儀進行分析，以氫氣作為載氣，程序升溫(初始柱溫185℃保持1min，以 7 ℃/min升高到 235℃保持 2.5min)，脂肪酸甲酯的水平根據(jù)內(nèi)標十七烷酸甲酯進行相對量化，脂肪酸甲酯種類的鑒定根據(jù)GC-MS氣-質(zhì)聯(lián)用(Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 5975C質(zhì)譜儀)中其與標準品的相對遷移速率進行計算，除了使用氦氣作為載氣外，其余色譜條件與上述相同。

剩余的總脂提取物進行TAG分析：在氮氣中干燥后提取物重懸于100μL氯仿∶甲醇(6∶1, v/v)溶液，然后進行硅膠60薄層層析(Sigma-Aldrich公司)，溶劑為庚烷∶乙醚∶醋酸(70∶30∶1, v/v/v)；碘蒸汽輕微染色，根據(jù)與TAG標準品共遷移速率確定TAG條帶；從層析板回收TAG組分，重溶于0.4mL甲苯和1.5mL硫酸甲醇溶液( 2.5%, v/v)中。TAG中FAMEs的色譜分析方法同上。

不飽和脂肪酸的雙鍵位置由脂肪酸甲酯衍生物的GC-MS分析結(jié)果確定：多不飽和脂肪酸的雙鍵位置由其吡咯烷衍生物進行分析[28]，單不飽和脂肪酸的雙鍵位置由其二甲基二硫醚衍生物進行分析[29]。所用GC-MS儀同上，層析柱為DB-1MS(Agilent，長30cm，內(nèi)徑0.25mm，膜厚度為0.25μm)。程序升溫條件為：初始柱溫185℃保持1min，以 10℃/min升高到 320℃保持 10min。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺氮培養(yǎng)對C-169生長的影響

圖1為C-169分別在光合自養(yǎng)的正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下的生長情況(接種密度為0.5×106cells/mL)。如圖所示，C-169在正常培養(yǎng)條件下(BBM+N)前2天生長緩慢，第3天進入指數(shù)生長期，至第12天密度達到4.03×107cells/mL。根據(jù)預實驗結(jié)果，C-169在此培養(yǎng)條件下第13天后生長速率下降，約18～19d后進入平臺期，細胞密度可達約5.5×107cells/mL(結(jié)果未顯示)。而在缺氮(BBM-N)培養(yǎng)基中，C-169前2天生長較快，甚至快于BBM+N組，這個結(jié)果與海洋柵藻中的類似[21]，推測缺氮條件刺激其產(chǎn)生某種應激反應從而暫時加速了細胞分裂。從第3天開始BBM-N組的生長速率降低，至第10天起細胞密度維持在大約1.6×107cells/mL。

從結(jié)果可見，膠球藻C-169是生長速率較高的藻種，最終達到的細胞密度與小球藻相當，因此具有進行大規(guī)模培養(yǎng)的潛力。C-169在BBM+N培養(yǎng)基中最終細胞密度約為初始細胞密度的80倍，而在BBM-N培養(yǎng)基中也有約33倍，遠高于如衣藻等綠藻[20]，有可能C-169對氮源的需求較低，因此在缺氮培養(yǎng)下還可以相對維持更長時間的生長。

圖1 C-169在正常和缺氮培養(yǎng)條件下的生長比較

2.2 尼羅紅染色顯微觀察缺氮培養(yǎng)對C-169油脂積累的影響

尼羅紅染色劑是一種親脂性的惡嗪類熒光染料, 能進入細胞與胞內(nèi)中性脂結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號, 其強度與細胞的中性脂含量呈線性關(guān)系[30]，因此可以利用尼羅紅染色對微藻油脂的積累量進行即時的顯微觀察。

圖2為尼羅紅染色后在熒光顯微鏡下所顯示出的藻細胞中油滴的大小及其熒光強度。從圖中可以看出，培養(yǎng)初期對照組(BBM+N)和缺氮組(BBM-N)的C-169藻細胞中均沒有油滴的形成；而隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組由于保持充足的氮源因此直到實驗結(jié)束也未見油滴生成，而缺氮組從第4天開始細胞內(nèi)明顯開始發(fā)生變化，在細胞周邊開始出現(xiàn)微小的熒光顆粒，到第5～6天已經(jīng)非常明顯是較小的油滴顆粒，之后細胞內(nèi)油脂逐漸積累，油滴顆粒也逐漸融合變大，在第12天達到最大，此時熒光強度也最強。因此選取這3個時間點作為數(shù)據(jù)分析的重點：第0天為對照，第4～6天代表油滴的最初形成期，第11～12天代表油滴積累的最高值，后面油脂含量和脂肪酸組成的分析也同樣是選取了這3個階段進行。

(第二行為熒光顯微圖像，在本實驗條件下尼羅紅染色的油滴發(fā)紅色熒光；第一行為可見光和熒光疊加的影像，以顯示細胞及其積累油滴的大小。Pictures on the second line is the fluorescent images and the red fluorescence was emitted by the lipid drops stained with Nile Red; Pictures on the first line is the overlapping images with visible and fluorescent lights to show the sizes of cell and lipid drops.)

圖2 尼羅紅熒光顯微觀察C-169細胞內(nèi)油滴的積累
Fig.2 Nile Red fluorescent observation of lipid accumulation for C-169

2.3 缺氮培養(yǎng)對C-169積累油脂含量以及脂肪酸組成的影響

從尼羅紅染色熒光顯微觀察可以看出，缺氮培養(yǎng)可以顯著增加C-169油脂積累，但這些油脂的增加主要是極性脂還是TAG這類非極性脂還需要驗證，因此分別分析了總脂以及經(jīng)過TLC分離的TAG中的脂肪酸(FA)含量及組成。

圖3是C-169在光合自養(yǎng)條件下的脂肪酸含量和成分分析。圖3A根據(jù)C-169細胞總脂的FA含量作圖，在BBM+N組中總FA的含量變化不顯著(P=0.436>0.05)，在BBM-N組中總FA的含量隨培養(yǎng)時間逐漸增加，由第0天的0.792ng/1 000cells增長到第12天 1.521ng/1 000cells，有了較為顯著的提高(P=0.047 <0.05)。圖3B是根據(jù)C-169總脂中TAG成分的FA含量進行作圖，與總脂中的FA含量一樣，在BBM+N組中FA的含量變化一直不顯著(P=0.137≥0.05)，但在BBM-N組中FA的含量隨培養(yǎng)時間逐漸增加，由開始的0.089ng/1 000cells增長到第12天 1.135ng/1 000cells(P=0.017<0.05)。圖3C顯示的是TAG中的FA占總脂F(xiàn)A的百分比，與上面的結(jié)果類似，在BBM+N組，這個比例差別不大(P=0.570>0.05)，保持在10%左右；而在BBM-N組，該比例在第4天的數(shù)據(jù)中就已經(jīng)明顯升高，從開始的11.4%升高到42.9%，到第12天為74.6%，表明此時總脂中約3/4為TAG，在缺氮條件下TAG成為C-169細胞內(nèi)油脂的主要成分(P=0.014<0.05)。

圖3 光合自養(yǎng)條件下C-169細胞中總脂肪酸以及積累TAG的脂肪酸含量

在有充足氮、磷等元素的培養(yǎng)條件下，微藻細胞中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)正常合成，脂肪酸主要用于合成極性脂如甘油為骨架的磷脂[31-32]，而TAG作為碳源和能量的一種儲存形式此時處于一個較低的水平，例如本實驗中C-169在正常培養(yǎng)條件下TAG占總脂的比例一般僅有10%左右。而在缺氮培養(yǎng)條件下，葉綠素含量下降(藻細胞顏色由綠變黃)，光合作用減弱，藻細胞的代謝平衡被打破，能量和營養(yǎng)物質(zhì)不再向生長方向輸送，生長和分裂停止，藻細胞還會逐漸將一些含氮較高的物質(zhì)(例如不需要的蛋白質(zhì))分解掉，轉(zhuǎn)而合成含氮量較低的儲存物質(zhì)，其中主要為TAG[20]。C-169同樣遵循這樣一個油脂積累的步驟，BBM-N組培養(yǎng)到第12天總脂比開始時增加了不到1倍，但其中TAG卻達到了開始時的近7倍，因此在缺氮培養(yǎng)條件下所增加的油脂主要為非極性的TAG。

(以第0天樣品為對照。The sample used for inoculating was treated as Control.)

圖4 培養(yǎng)12 d后C-169細胞內(nèi)總脂和TAG的脂肪酸組成分析
Fig.4 The fatty acid composition of total lipid and TAG of C-169 after 12 days cultivation

經(jīng)GC-FID分析，C-169的脂肪酸主要由十六碳和十八碳脂肪酸組成，圖4為實驗結(jié)束時(培養(yǎng)了第12天)的總脂(A)和TAG(B)中脂肪酸組成的分析，其數(shù)值顯示的是各種脂肪酸分別占據(jù)總脂和TAG中脂肪酸的百分比，而非絕對值。從圖中可見，缺氮培養(yǎng)條件下變化最大的就是極大促進了油酸(18∶1)的生產(chǎn)，分別占總脂肪酸含量的48.17%和TAG脂肪酸的58.03%，比BBM+N組有極顯著的提高(P<0.01)，而且即使是BBM+N組的C-169在經(jīng)過12d培養(yǎng)后其TAG脂肪酸中油酸的比例也有很大提高(P=0.002<0.01)。此外，BBM-N組中硬脂酸(18∶0)的比例也都比BBM+N組高，但對于TAG來說提高并不顯著。棕櫚油酸(16∶1)在TAG中只有在BBM-N組中積累，盡管僅占0.47%，但其在總脂肪酸中的比例在缺氮條件下反而下降了。除了上述3種FA之外，C-169中的主要FA，包括棕櫚酸(16∶0)、十六碳二烯酸(16∶2)、亞油酸(18∶2)、γ-亞麻酸(GLA)(18∶3)、α-亞麻酸(18∶3)、亞麻油酸(SAT)(18∶4)等在缺氮條件下都有所下降，總的趨勢是多不飽和脂肪酸含量降低而單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的含量升高，棕櫚酸(16∶0)、棕櫚油酸(16∶1)以及硬脂酸(18∶0)和油酸(18∶1)的和分別占總脂肪酸含量的67.13%和TAG脂肪酸含量的71.54%，其中占絕對優(yōu)勢的是油酸(18∶1)。

按化學成分分析, 生物柴油燃料是一種高脂酸甲烷, 它是通過以不飽和油酸C18為主要成分的甘油脂分解而獲得的[33]，由于它與柴油分子中碳數(shù)相近，因而燃燒性能也與石化柴油類似，故成為有力的替代能源。而從生物柴油產(chǎn)品十六烷值、碘值、氧化安定性等燃料特性考慮，高品質(zhì)生物柴油的原料中應該具有較高的單不飽和脂肪酸含量[34]。因此，適宜用作生物柴油的油脂脂肪酸組成以直鏈的C16或C18飽和或單不飽和脂肪酸為最佳[35]。膠球藻C-169在缺氮培養(yǎng)下其C16或C18飽和或單不飽和脂肪酸含量在總脂和TAG中都具有非常高的比例，尤其是油酸(18∶1)占絕對優(yōu)勢都符合高品質(zhì)生物柴油對原料油特性的要求。

3 結(jié)語

本文分析了膠球藻C-169在缺氮條件下的生長速率和油脂含量，發(fā)現(xiàn)該單細胞綠藻具有較高的生長速率，即使在營養(yǎng)缺乏的情況下還保持了一定的生長，由于利用營養(yǎng)脅迫促進微藻積累油脂往往需面對藻細生長胞停滯，生物量不足的問題，這種生長速率上的優(yōu)勢具有一定的應用價值。其次，它在缺氮培養(yǎng)條件下所積累的油脂以C16或C18飽和或單不飽和脂肪酸為主，其中油酸的量占據(jù)了中性脂TAG的一半以上，符合生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油的要求。總之膠球藻C-169是一種較為優(yōu)良的能源微藻藻種，可進一步深入研究為生物能源的產(chǎn)業(yè)化服務(wù)。

致謝：感謝美國內(nèi)布拉斯加大學林肯分校的Heriberto Cerutti教授對本研究的指導。

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責任編輯 高 蓓

Effects of Nitrogen Deprivation onCoccomyxasp. C-169 for Its Lipid Accumulation and Fatty Acid Composition

XU Di, CAO Xiao-Fei, ZHANG Xiao-Zhou, ZHANG Xue-Cheng

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

With the increasing problem of lacking of oil natural resources, a great intentions have been focused on the biodiesel production from microalgae all over the world. In order to realize this bio-energy industry, selecting the high oil content algal species or breedings is the key work. The effects of nitrogen deprivation on the growth, lipid content and fatty acids composition ofCoccomyxasp. C-169 were examined here. Under nitrogen starve, the growth speed of C-169 started to lag behind the control group from the 3rd day and the cell density maintained at about 1.6×107cell/ml after 10 days which was 33 times higher than the inoculating density. Furthermore, the Nile Red fluorescent microscopic observation showed that the lipid accumulation reached its highest level on day 12. At this point, the fatty acid content of total lipid was 1.135 ng/1 000 cells compared with 0.089 ng/1 000 cells of control and the portion of TAG in total lipid was 74.6%. The fatty acid composition of TAG was composed of C16 and C18 saturated or mono-unsaturated fatty acid mostly and the oleic acid (18∶1) was especially high which was occupying more than half. So it shows thatCoccomyxaC-169 may be a suitable candidate for the high quality biodiesel production.

Coccomyxasp. C-169; Nitrogen deprivation; lipid accumulation; fatty acid composition

感謝廣西壯族自治區(qū)北海市科技項目(201203024)對本研究的支持。

2015-03-11；

2015-05-08

徐 滌(1972-)，女，副教授。E-mail: dixa@ouc.edu.cn

S968.41

A

1672-5174(2015)12-051-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20150060