覃 鴻，馬競一,，陳紹江，李衛(wèi)軍，嚴衍祿，王 平，劉 金

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光照強度和光闌孔徑對近紅外漫透射光譜鑒別單倍體玉米影響研究

覃 鴻1，馬競一1,2，陳紹江3，李衛(wèi)軍1，嚴衍祿4，王 平2，劉 金3

（1. 中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所，高速電路與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實驗室，北京 100083； 2. 中國石油大學(xué)（華東），信息與控制工程學(xué)院，山東 青島 266580； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家玉米改良中心，北京 100193；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，北京 100083）

以同一品種同一批次玉米單倍體和多倍體個體種子為研究對象，基于近紅外光譜定性分析技術(shù)，分析研究了用漫透射光譜測量方式采集光譜時，不同光照強度和光闌孔徑得到的光譜曲線質(zhì)量以及對玉米單倍體種子鑒別結(jié)果的影響。光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后，采用PLS＋OLDA特征提取算法，應(yīng)用SVM建立玉米單倍體鑒別模型。分別統(tǒng)計多種不同實驗條件所測數(shù)據(jù)建立的鑒別模型的正確識別率。結(jié)果表明，光闌孔徑的大小影響光譜曲線信噪比，越接近玉米籽粒大小的孔徑獲得的光譜曲線越平滑；光照強度影響光譜曲線有效性，光照越強，波形峰谷差值越大，識別率越高。選擇較高的光源強度和適合種子大小的光闌，可以得到高質(zhì)量的光譜曲線，以此建立的玉米單倍體鑒別模型，識別率達到了100%。

近紅外光譜；漫透射；定性分析；玉米單倍體

0 引言

單倍體育種技術(shù)是生物技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合產(chǎn)生的一條快速、高效育種新途徑[1-2]，而玉米自然產(chǎn)生單倍體的概率極低[3]，所以快速、準(zhǔn)確地識別出單倍體籽粒對玉米單倍體育種非常必要。目前國內(nèi)外對玉米單倍體檢測鑒定的方法主要有：形態(tài)學(xué)鑒定、細胞學(xué)和解剖學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定、射線照射、遺傳標(biāo)記法等[4-6]，但以上方法存在耗時耗力成本高等缺陷[7]，且多為有損檢測，無法實現(xiàn)玉米單倍體籽粒的快速、無損檢測。

近紅外光譜（NIR）分析技術(shù)具有分析速度快、無損、測試成本低的特點，并且易于實現(xiàn)在線分析，在農(nóng)作物品種鑒別中的應(yīng)用研究已經(jīng)非常廣泛[8]。近紅外光譜波長范圍為780～2500nm，可應(yīng)用于檢測樣品中有機分子含氫基團的特征信息。李晉華等[9]將近紅外漫透射技術(shù)用于檢測玉米成分，與國家標(biāo)準(zhǔn)測量方法測得結(jié)果進行對比分析，誤差均小于0.5%。唐興田等[10]將漫透射方法應(yīng)用于玉米群體樣品品種真實性鑒定，平均正確識別率和拒識率分別達到98.50%和98.00%。在近紅外漫透射分析方法中，照射光源對光譜質(zhì)量有較大影響，但是目前還沒有針對光源方面的研究。本文以同一批次同一品種玉米種子為研究對象，基于近紅外漫透射光譜分析的方法，從光源強弱和進光量大小兩個方面進行研究，探討其對光譜曲線質(zhì)量和玉米單倍體識別率的影響，以期為進一步建立準(zhǔn)確高效的近紅外漫透射實驗平臺提供參考。

1 實驗原理

玉米種子屬于活體、非均勻、高濃度樣品，其不可分割，截光面積小等特點對玉米單籽粒近紅外光譜分析造成了困難。近紅外光照射到物品時，有吸收、透射和反射的作用，待測樣品對入射光經(jīng)多次吸收、散射后部分光透過樣品到達檢測器成為漫透射光。根據(jù)近紅外不同譜區(qū)的光譜特征[8]，單籽粒近紅外漫透射分析的最佳譜區(qū)為中波近紅外區(qū)段。中波近紅外光對種子透過率約10%～50%左右，在中波分析的典型光程（數(shù)mm）中，可以充分負載樣品信息。玉米種子在中波近紅外光照射下，接近半透明狀態(tài)，漫透射分析不均勻樣品可以實現(xiàn)分析光程縱深信息全累加，容易得到玉米籽粒內(nèi)部信息，最大限度消除位置效應(yīng)對分析的影響。光譜分析的基礎(chǔ)是采集正確的光譜，避免光譜失真。光源是光譜信息采集的能量來源，光譜儀是光譜信息的采集設(shè)備，要想獲得正確的光譜，光源的強度和光譜儀的進光量是2個重要影響因素。光源的強度影響光譜的信噪比，光譜儀進光量影響探測器接收到的有效光譜信息成分多少。為了探究以上2種因素對光譜形狀和玉米單倍體識別率影響，設(shè)計以下實驗。

2 實驗部分

2.1 儀器設(shè)備

實驗儀器用美國JDSU公司的MicroNIR-1700系列的微型近紅外光譜儀（圖1），儀器參數(shù)如下：光源為雙集成真空鎢燈，分光元件：線性漸變?yōu)V光片（LVF），探測器類型：128線元非制冷銦鎵砷（InGaAs）二極管陣列，波長范圍：950～1650nm，分辨率：12.5nm，測量時間（典型值）：0.25s。單籽粒漫透射樣品測試使用附件：額定電壓12V、額定功率為10W、20W和35W三種規(guī)格鹵鎢杯燈和三種不同孔徑2.2mm、5.2mm和8.2mm的光闌。

圖1 微型近紅外光譜儀

漫透射分析使用自行搭建的裝置，該裝置將鹵鎢燈杯置于光譜儀上方，高度與照射角度可調(diào)。光束照射到待測樣品，穿透玉米籽粒的漫透射光經(jīng)過光闌，被光譜儀探測器采集到，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)線傳輸至電腦，應(yīng)用光譜儀自帶軟件保存樣品光譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析軟件為Matlab 2010b（美國，Mathworks公司）。

2.2 樣品來源與光譜采集

實驗用國家玉米改良中心提供的導(dǎo)入Navajo遺傳標(biāo)記后雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生的鄭單958玉米單倍體和多倍體籽粒作為研究對象。在2014年5月21日同一時間段同一外界環(huán)境下，選用3種不同規(guī)格鹵鎢燈光源和3種不同孔徑光闌進行數(shù)據(jù)采集。采集玉米籽粒光譜時，單倍體和多倍體交叉采集，以減小儀器參數(shù)漂移對實驗結(jié)果影響[11]。每組實驗玉米單倍體和多倍體籽粒各采集30條光譜，為了便于比較，不同組實驗所用的玉米籽粒完全相同。

2.3 實驗方法

原始光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理[11]采用平滑（Smoothing）、一階導(dǎo)（First Derivative，F(xiàn)D）和矢量歸一化（Vector Normalization，VN）相結(jié)合的方法。

原始光譜進行上述預(yù)處理后，采用PLS＋OLDA對數(shù)據(jù)進行特征提取。偏最小二乘回歸（PLS）[12-13]數(shù)據(jù)分解和回歸結(jié)合為一步，得到的特征值向量直接與被分類品種性質(zhì)相關(guān)，提取的綜合成分能夠最大的反應(yīng)出類別信息特點。正交線性鑒別分析（OLDA）是對LDA的一種改進。線性鑒別分析（LDA）是一種經(jīng)典有效的維數(shù)簡約方法。它通過尋找一個鑒別矢量組成的投影矩陣，使得原始數(shù)據(jù)在向低維空間投影時，同類樣本盡可能集中，非同類樣本盡可能分散，即類間散布與類內(nèi)散布比值最大[14]。而OLDA[15]使得判別向量是一組相互正交的投影向量。

本文采用支撐向量機（SVM）方法建立玉米單倍體鑒別模型。SVM方法是一種機器學(xué)習(xí)方法，通過一個非線性映射，把樣本空間映射到一個高維乃至無窮維的特征空間中，使得在原來的樣本空間中非線性可分的問題轉(zhuǎn)化為在特征空間中的線性可分的問題。SVM方法[16]常用于二分類問題，所以我們選擇SVM作玉米單倍體和多倍體識別問題的分類器。

為了分析光源強度和光闌大小對光譜曲線及玉米單倍體識別率的影響，設(shè)計了如下實驗：第一組實驗使用同一35W鹵鎢杯燈對玉米籽粒進行照射；第二組實驗使用同一直徑的光闌，分別用額定功率為10W、20W和35W三種規(guī)格鹵鎢杯燈照射玉米籽粒。分別統(tǒng)計多種不同實驗條件所測數(shù)據(jù)建立的鑒別模型的正確識別率以及光譜曲線圖。

3 結(jié)果與分析

第一組實驗使用同一鹵鎢杯燈（額定功率35W）對樣品進行照射，鹵鎢杯燈工作在額定電壓12V、電流2.9A條件下，分別用3種不同直徑光闌采集數(shù)據(jù)。得到光譜圖和識別結(jié)果如圖2所示。

對比圖2中應(yīng)用3種不同直徑的光闌得到的原始光譜圖，發(fā)現(xiàn)5.2mm的光闌得到的光譜曲線最平滑，光譜吸光度區(qū)間在0～0.14，離散度約0.14，3個波峰形狀明顯。而2.2mm的光闌得到的光譜吸光度區(qū)間在0～0.2，離散度約0.2，而且曲線信噪比大，在全譜區(qū)都有較多毛刺，且在波長900～1000nm區(qū)間的第一波峰畸變嚴重。對于8.2mm光闌采集到的光譜離散度約0.14，整體較平滑，但是在第一波峰有少許毛刺，而且曲線在波長1400～1700nm區(qū)間離散度較大，約為0.06，遠大于5.2mm的光闌得到的光譜曲線在此區(qū)間離散度值0.02。由此可得出結(jié)論，在漫透射實驗中，采用5.2mm的光闌最合適。

第二組實驗使用5.2mm的光闌，分別用額定功率為10W、20W和35W三種規(guī)格鹵鎢杯燈照射玉米籽粒，同樣使其工作在額定電壓12V下，其他實驗條件相同。得到實驗光譜圖和玉米單倍體和多倍體識別率如圖3和表2所示。

圖2 玉米籽粒原始光譜

表1 識別率百分數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

表2 識別率百分數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

圖3 玉米籽粒原始光譜

通過對比圖3中(a)、(b)和(c)圖，看出適當(dāng)提高鹵鎢燈光源功率，可以起到減小信噪比、提高光譜峰谷差值效果。從表2中玉米單倍體和多倍體識別率百分數(shù)統(tǒng)計結(jié)果看，使用的鹵鎢燈功率越大，識別率越高。由此得出結(jié)論，在漫透射實驗中，應(yīng)盡可能選擇更高強度的光源。

從以上分析得知，光闌直徑大小影響光譜儀探測器進光量，從而影響光譜曲線信噪比。光闌直徑過小，會使探測器無法獲得足夠的光譜信息，噪聲等影響因素所占比重過高，導(dǎo)致光譜曲線毛刺過多。無法得到高效的平滑的光譜。光闌直徑過大，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，會出現(xiàn)漏光導(dǎo)致光譜畸變現(xiàn)象。由于玉米籽粒屬于不規(guī)則樣品，形狀大小差別很大，有些較小的玉米籽粒無法完全遮蓋住圓形小孔，致使有部分光直接照射到光譜儀探測器上。這樣不僅無法測得準(zhǔn)確的玉米籽粒漫透射光譜，還會損壞光譜儀。近紅外中波分析的兩個主要譜區(qū)為：三倍頻1180nm和二倍合頻1400nm。光譜曲線在波長1100nm和1300nm處的峰谷差大，說明光譜攜帶的玉米籽粒內(nèi)部信息越豐富，越利于對玉米單倍體和多倍體籽粒進行分類識別。

4 結(jié)語

研究了近紅外漫透射光譜分析中，光源強度和光闌大小對玉米單倍體鑒別結(jié)果的影響。結(jié)果表明，對于本批玉米品種，不同光源強度會對光譜峰谷差有較大影響。光源功率越大，有效區(qū)間中光譜峰谷差越大。光闌直徑的大小直接影響光譜曲線信噪比，只有選擇合適直徑的光闌，才能得到平滑光譜。選擇35W鹵鎢杯燈和5.2mm光闌，可以得到最有效光譜和最高的識別率。由于本文僅涉及同一時間段同一品種的玉米籽粒，實驗結(jié)果可能需要在更大樣品集和更長實驗周期中進一步加以驗證。

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Research on the Effect of the Intensity and Amount of Light Source to Maize Haploid Identification Based on Near Infrared Diffuse Transmission

QIN Hong1，MA Jing-yi1,2，CHEN Shao-jiang3，LI Wei-jun1，YAN Yan-lu4，WANG Ping2，LIU Jin3

(1.,,100083,; 2.,(),266580,; 3.,,100193,; 4.,,100083,)

Aiming at the same batches of the same variety corn seeds, this paper studied the influence factors about the spectral curve quality and the recognition rate of maize haploid identification based on NIR qualitative analysis technology. The factors were studied from the two aspects which were the light intensity and diaphragm aperture with the diffuse transmission spectrum measurement way. Partial least squares-discriminant analysis (PLS-OLDA) was used to compress the pretreated spectral data, and then the identification models were built based on Support Vector Machine (SVM). The measured data were recorded under different experimental conditions and the recognition correct rates were calculated. The results showed that the signaltonoiseratio of light spectral curve is affected by the amount of light through the diaphragm, and the closer to the seed size the aperture diameter of the diaphragm is, the smoother spectrum would be got. The intensity of light source directly influenced the spectrum curve’s effect, and the stronger the light energy, the greater wave peak to valley difference，and at the same time the recognition rate is higher. The results showed that the recognition rate of maize haploid and hybrid reached 100% based on the higher light power and appropriate diaphragm.

near infrared spectroscopy，transmittance spectra，qualitative analysis，maize haploid

O657.3；S123

A

1001-8891(2015)01-0078-04

2014-10-10；

2014-11-06.

覃鴻（1977-），女，壯族，廣西人，博士，研究方向為智能信息處理技術(shù)，近紅外光譜定性分析技術(shù)。E-mail：qinh@semi.ac.cn。

李衛(wèi)軍，E-mail：wjli@semi.ac.cn。

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項，編號：2014YQ470377。