郭　龍　湯細彪　劉　田　董　超　劉　峰　喻紅艷　吳　斌

華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心，武漢430070

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2014年豬群常見細菌性疫病的分離鑒定與流行病學調(diào)查

郭龍湯細彪劉田董超劉峰喻紅艷吳斌

華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心，武漢430070

摘要2014年華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心對湖北、湖南、河南、廣東、浙江等21個省市送檢的12 452份臨床病料進行細菌分離、生化試驗和PCR方法鑒定，共分離出3 926株致病菌，并對其中所分離到的225株副豬嗜血桿菌和231株鏈球菌采用玻片凝集方法進行血清型分型。結果表明鏈球菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、波氏桿菌、致病性大腸桿菌和豬丹毒絲菌等9種病原菌已嚴重影響我國規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的健康生產(chǎn)。

關鍵詞豬；細菌；血清型；分離鑒定；流行病學

郭龍，男，碩士，華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心細菌室主任。

1　材料與方法

1.1病料及來源

病料采集于湖北、湖南、河南、廣東、浙江、安徽、江西、河北、福建、山東、上海等21個省市的發(fā)病豬場，分離組織主要包括出現(xiàn)病理變化的肺、氣管、腦、關節(jié)、脾臟以及淋巴結等。

1.2主要材料及儀器

胰蛋白大豆肉湯（TSB）和胰蛋白大豆瓊脂（TSA）購自美國Becton Dickinsonand Company公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又稱V因子）購自中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司；犢牛血清購自杭州四季青公司；麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基和生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑公司，CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Forma公司；生物顯微鏡購自Nikon公司，鏈球菌和副豬嗜血桿菌分型所用標準血清為本實驗室制備和保存。

1.3細菌初步分離

在超凈工作臺中，對各臟器表面進行消毒，嚴格無菌操作取各臟器深層一小塊組織，將所取組織均勻涂抹于含犢牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基一角，分區(qū)劃線，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48 h。

1.4細菌的純化鑒定

在培養(yǎng)好的原代TSA平皿中用無菌的接種環(huán)挑取菌落少許，作抹片、革蘭氏染色、鏡檢。若其染色和細菌形態(tài)與懷疑的致病菌一致，可挑取1個單菌落進行傳代培養(yǎng)，所得培養(yǎng)物為純培養(yǎng)菌株。純培養(yǎng)物的目的在于對分離的病原菌進一步進行生化鑒定和其他試驗。

1）鏈球菌的鑒定。

形態(tài)特征：為革蘭氏陽性菌，在臟器圖片標本中呈單個或成對卵圓形，菌落小，灰白，透明，液體培養(yǎng)染色呈短鏈狀排列。

培養(yǎng)特性：普通瓊脂培養(yǎng)平板上37℃培養(yǎng)24 h后長成灰白色透明的小菌落，多呈β型溶血。

2）副豬嗜血桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏陰性桿狀菌，具有多形性，從球桿狀到纖細狀。

培養(yǎng)特性：本菌在巧克力瓊脂上培養(yǎng)48～72 h依然生長很差，菌落為光滑型，灰白色透明，不溶血，本菌生長嚴格需要V因子，不需要X因子。如果與金黃色葡萄球菌同時劃線37℃培養(yǎng)24～48 h后，有典型的“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”，并且副豬嗜血桿菌菌落周圍不溶血。

生化特性：氧化酶試驗陰性，接觸酶試驗陽性，尿素酶試驗陰性，不長生靛基質，不溶血，CAMP試驗陰性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖等碳水化合物。

3）巴氏桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏染色呈紅色的細小球桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染。

培養(yǎng)特性：血液瓊脂平板上生長良好，24 h長成淡灰色、露珠樣小菌落，表面光滑閃亮，邊緣整齊，不溶血。在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。

生化特性：不形成靛基質，不液化明膠，產(chǎn)生硫化氫和氨，MR、VP陰性。

4）波氏桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏陰性、兩極著色、散在或成對排列、呈細小球桿狀菌。

培養(yǎng)特性：血液瓊脂平板上生長良好，48 h長成淡灰色、露珠樣小菌落，表面光滑閃亮，邊緣整齊，不溶血。在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。乳黃色、表面光滑、邊緣整齊、中心隆起、黏稠、扁平。

生化特性：尿素酶試驗陽性、能利用檸檬酸鹽、還原硝酸鹽、不產(chǎn)生靛基質、不產(chǎn)生硫化氫、MR和VP試驗均為陰性、不液化明膠，不氧化也不發(fā)酵包括葡萄糖在內(nèi)的所有糖。

5）大腸桿菌的鑒定。

形態(tài)特征：革蘭氏陰性短桿菌，周身鞭毛，在組織和滲出液圖片染色標本中常呈兩級著色（比巴氏桿菌大），要注意同巴氏桿菌區(qū)別。

培養(yǎng)特性：普通瓊脂平皿上37℃培養(yǎng)24 h后，長成圓形、微隆起、濕潤、半透明無色菌落。一些致病菌株在綿羊血平板上呈β型溶血。在麥康凱瓊脂上長成紅色菌落。

6）豬丹毒絲菌的鑒定。

形態(tài)特征：革蘭氏染色鏡檢后可見革蘭氏陽性兩端鈍圓或彎曲的細小桿菌，易形成長絲狀。

培養(yǎng)特性：分離的細菌在TSA培養(yǎng)基上細菌菌落為圓形、透明、灰白色，針尖大小、光滑、濕潤、露珠樣的小菌落，培養(yǎng)基中加入血清、葡萄糖、蛋白水解物或表面活性劑吐溫- 80，可促進細菌的生長。

1.5分型方法

本實驗室利用副豬嗜血桿菌血清1～15型標準菌株成功地制備出15種血清型高免血清（副豬嗜血桿菌15個血清型標準株由澳大利亞昆士蘭動物研究中心饋贈），鏈球菌標準血清采用標準株抗原靜脈注射家兔制備。將從臨床分離鑒定出的副豬嗜血桿菌和鏈球菌純化擴大培養(yǎng)，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，保證菌量為30億/mL，取約3 mL副豬嗜血桿菌菌液裝入青霉素瓶放入高壓蒸氣滅菌鍋爐121℃，高溫處理30 min后放于離心機7 000 r/min離心2 min，所得上清液即為待檢抗原，待定型鏈球菌只需用無菌生理鹽水將菌苔洗下，無需高溫處理和離心。取載玻片1張，用移液器分別吸取血清及抗原10 μL，用牙簽將血清和抗原充分混勻，輕輕搖動玻片1～2 min，在診斷血清中，如混懸液由混濁變澄清并出現(xiàn)肉眼可見的凝集絮狀物為陽性結果；如與對照相同，則為陰性結果。

2　結果統(tǒng)計

2.1分離細菌統(tǒng)計

本實驗室對2014年全國各地所送檢的12 452份臨床樣品進行細菌分離，各省病原菌的分離情況見表1，從送檢病料中共分離到致病菌3 926株，其中鏈球菌1 469株占所分離細菌總數(shù)37.42%，副豬嗜血桿菌883株占22.49%，巴氏桿菌556株占14.16%，波氏桿菌153株占3.9%，沙門菌227株占5.78%，大腸桿菌367株桿菌占9.35%，豬丹毒絲菌94株占2.39%，葡萄球菌155株占3.95%，豬傳染性胸膜肺炎23株占0.59%。

2.2部分細菌血清分型統(tǒng)計

1）副豬嗜血桿菌血清分型。

對2014年部分省份所分離到的副豬嗜血桿菌隨機選取225株進行了血清型分型。統(tǒng)計結果顯示：我國副豬嗜血桿菌主要流行血清型為4型（占32.89%）、5型（25.33%）、13型（13.78%）。

2）鏈球菌血清分型。

2014年本實驗室對部分省份分離到的231株鏈球菌進行血清型定型，其中1型（7株）占總體比例為3.03%；2型（103株）為44.59%；3型（5株）為2.16%；5型（5株）為2.16%；7型（39株）為16.88%；9型（35）株為15.15%；未定出型（37株）為16.02%。其中，未定出型的37株鏈球菌有2種可能：一是該鏈球菌為非豬源鏈球菌，二是該鏈球菌的血清型不屬于這6種。

3　分析與討論

2014年華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心共針對全國規(guī)?；B(yǎng)殖場所送檢的12 452份樣品進行細菌分離，共分離到3 926株致病菌，其中鏈球菌（1 469株）和副豬嗜血桿菌（883株）占分離總數(shù)的59.91%，豬鏈球菌有35個血清型，副豬嗜血桿菌現(xiàn)已知有15個血清型以上，其血清型間的交叉免疫原性差，并且具有地方流行性，而當前我國副豬嗜血桿菌主要流行血清型為4型、5型，豬鏈球菌以2型、7型為主。因此有必要經(jīng)常對本場豬群抗體定期監(jiān)測和評估，并盡可能選擇與本場主要流行血清型相符合廠家的疫苗進行合理免疫，以增強保護力。伴隨我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度越來越高，細菌性疾病的發(fā)生趨勢逐漸復雜，以前危害較大的一些疾病如豬丹毒已不再是規(guī)?；i場主要防疫重點，而近2年很多地區(qū)養(yǎng)殖場岀現(xiàn)中大豬和種豬群突然高燒（可達41℃甚至以上）喘氣、突然發(fā)病且病程極短、死亡前口吐血沫、嘔吐以及神經(jīng)癥狀，部分皮膚上岀現(xiàn)棱形不規(guī)則斑塊，死亡后發(fā)紫敗血，解剖主要以肺臟水腫、岀血、氣管內(nèi)有大量泡沫、腎臟高度岀血腫大，且該情況多以散發(fā)和以中大豬為主。經(jīng)本實驗室系統(tǒng)病原學鑒定發(fā)現(xiàn)：其主要致病菌是豬丹毒，并伴隨豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒2型、豬鏈球菌病及豬傳染性胸膜肺炎等混合感染問題，其一般發(fā)病較急且中大豬損失較慘重。希望規(guī)模化豬場能高度重視。

表1　 2014年細菌分離統(tǒng)計株

細菌性疾病目前最好是通過日常必要藥物保健和疫苗免疫來進行預防。同時加強對飼料來源污染的生物因子的監(jiān)測力度，摸清豬場多重感染的原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染疾病的種類，建立豬場完善、合理的監(jiān)測方案，實施種豬場疾病凈化，建立健康的種豬群。一旦臨床癥狀已經(jīng)出現(xiàn)，應合理采用敏感藥物進行治療，發(fā)病期間應對整個豬群進行藥物預防，而不僅僅只是對那些表現(xiàn)出癥狀的豬用藥，抗生素預防或口服藥物治療對嚴重的細菌病毒多重感染可能無效，同時治療費時費力，成本高且易產(chǎn)生耐藥性。因此有條件的豬場可以考慮定期通過實驗室從典型發(fā)病豬中分離具有代表性致病菌進行藥敏試驗，且選擇敏感藥物合理使用，從而減少損失。

收稿日期：2015- 08- 30