甄濤，張穎，張先成，韓笑，商亮（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

甜菜根腐病生防菌株ASP-15抗菌物質(zhì)初步分析

甄濤，張穎，張先成，韓笑，商亮
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

通過對(duì)甜菜根腐病生防菌株克雷伯氏菌ASP-15抗菌物質(zhì)進(jìn)行初步分析，分別對(duì)多糖、核酸、蛋白進(jìn)行提取，采取抑菌試驗(yàn)選出抑菌能力最強(qiáng)的物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)抑菌能力最強(qiáng)的物質(zhì)是蛋白，在pH8.0時(shí)活性最高，而在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中活性有所下降，對(duì)溫度、紫外線照射、蛋白酶不敏感。說明蛋白是生防菌株ASP-15抑菌活性物質(zhì)，抗菌粗蛋白具有較強(qiáng)的酸堿、紫外線和酶的穩(wěn)定性。

抗菌蛋白；抑菌活性；穩(wěn)定性

隨著對(duì)植物病害防治要求的提高，傳統(tǒng)抗生素顯現(xiàn)出許多弊端［1］，如容易產(chǎn)生耐受性或抗性菌株，人們的注意力也轉(zhuǎn)移到了一類新的物質(zhì)抗菌蛋白，其具有廣譜、高效性，對(duì)病菌不易產(chǎn)生抗性［2］。

1　試驗(yàn)方法

1.1胞外多糖提取

取300m L發(fā)酵液5 000r/m in，10m in離心菌體取上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，調(diào)pH值至8.0，加入1.0g固定化蛋白酶，40℃、150rpm震蕩100m in。用固定化蛋白酶與Sevage法連用除蛋白：先用固定化蛋白酶處理樣品，可以降低蛋白的分子量，有利于蛋白的分離［3］。提取液：氯仿——正丁醇5:1混合，加入氯仿——正丁醇（5:1）劇烈振搖后，6 000r/m in離心10m in后，將液體倒入分液漏斗中，充分振蕩，去除有機(jī)相和蛋白層，保留水相。反復(fù)操作6次，直至蛋白層無黏稠狀為止［4］。水相離心取上清液10m L，用3倍體積95%乙醇至終濃度70%，4℃沉淀過夜，離心去除上清液，保留沉淀，獲得粗多糖。

1.2總DNA提取

TaKaRa細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.3粗蛋白提取

采用硫酸銨鹽析法獲得抗菌蛋白，取上述發(fā)酵上清液100m L，加入硫酸銨至20%飽和度，4℃靜置過夜沉淀抗菌蛋白。次日4℃，6 000rpm離心30m in，棄上清［5］。用l/10發(fā)酵液體積的0.02mo l/L磷酸緩沖液（pH 7.5）緩沖液懸浮，將懸浮液裝入透析袋（PEG8000）中透析除鹽，將透析袋內(nèi)物質(zhì)用聚乙二醇濃縮10m L，20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%重復(fù)上述操作。在4℃、12 000rpm條件下離心5m in，上清即為抗菌蛋白的粗提物。

1.4抗菌蛋白ASP-15穩(wěn)定性研究

1.4.1pH穩(wěn)定性

用1mol/LHCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至（從2～14），4℃過夜。將pH調(diào)至7.0測(cè)定抑菌活性［6］。

1.4.2紫外線穩(wěn)定性

將抗菌蛋白粗提物在28W紫外燈距離10cm處，分別照射1～9h后測(cè)定抑菌活性。

1.4.3蛋白酶穩(wěn)定性

分別用蛋白酶K、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶處理，每種酶質(zhì)量濃度為500μg/m L，37℃處理1 h。對(duì)處理后的樣品溶液測(cè)定抑菌活性。

2　結(jié)果與分析

2.1抗菌物質(zhì)活性測(cè)定

蛋白、多糖、核酸粗提物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抗菌蛋白粗提物產(chǎn)生的抑菌圈遠(yuǎn)大于多糖粗提物抑菌圈，核酸不產(chǎn)生抑菌圈。我們選取抑菌能力最強(qiáng)的蛋白進(jìn)行深入研究。

2.2pH穩(wěn)定性

抗菌蛋白pH比較穩(wěn)定，在pH 8.0時(shí)活性最高，而在2.0和14.0時(shí)活性下降。

2.3紫外線穩(wěn)定性

該抗菌蛋白對(duì)紫外線不敏感，經(jīng)紫外線照射不失活，對(duì)紫外線很穩(wěn)定。

2.4蛋白酶穩(wěn)定性

抗菌蛋白用不同的蛋白酶在37℃下處理1h后，對(duì)其進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶處理后，抗菌蛋白為未經(jīng)處理的抑菌活性的87.3%、84.4%和82.5%，說明抗菌蛋白對(duì)蛋白酶不敏感。

3　結(jié)論

分別對(duì)蛋白、多糖、核酸進(jìn)行分離純化獲得其粗提物，通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白抑菌能力最強(qiáng)，多糖有抑菌能力很弱，核酸無抑菌能力?？咕鞍}析最佳硫酸銨飽和度為40%?？咕鞍讓?duì)紫外穩(wěn)定性及蛋白酶不敏感，需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)理研究。

［1］昌華.B-HCH菌株的培養(yǎng)及代謝物的初步研究中目［J］.生物防治，1996，（01）：11-14.

［2］程亮.拮抗細(xì)菌的研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，（5）.

［3］扈瑞平.沙蔥多糖Sevage法除蛋白工藝的研究［J］.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，（6）.

［4］光域.硫酸——苯酚定糖法的改進(jìn)與初步應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2005，（08）：342-346.

［5］謝棟.枯草芽孢桿菌抗菌蛋白X98Ⅲ的純化與性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，1998，（01）：13-19.

［6］陳海英.拮抗細(xì)菌在植物病害防治中的應(yīng)用及展望［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（20）：8690-8691.

Prelim inary Analysis of Antim icrobial Substances of Sugarbeet Root rot Biocontrol ASP-15

ZHEN Tao，ZHANG Ying，ZHANG Xian-cheng，HAN Xiao，SHANG Liang
（SchoolofResourcesand Environment，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin 150030，China）

Thispapermade research on beet root rotbiocontrolstrain Klebsiella ASP-15 antimicrobialsubstances. Polysaccharides，nucleic acids，proteinswere extracted，the strongestantibacterial substanceswere selected through inhibition test.Strongestantibacterialsubstance is a protein，thehighestactivity atpH8.0，while in acid and alkali environmentdecreased activity，temperature，ultraviolet radiation，protease sensitive.Protein is biocontrol ASP-15 antibacterialsubstances，anti-bacterialcrude protein hasa strong pH stability，UV and enzymes.

Antifungal protein；Antagonistic activity；Stabilty

S476.1

A

1674-8646（2015）05-0024-02

2015-05-15

甄濤（1986-），男，山東泰安人，學(xué)士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事基因工程、生物肥料研究。