阮亮亮，鄭培永，楊佳泓，范錦立，甘榮興

生物樣本庫RNA質(zhì)量控制的方法學(xué)驗(yàn)證

阮亮亮，鄭培永，楊佳泓，范錦立，甘榮興

目的對現(xiàn)有的RNA樣本質(zhì)量控制的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法RNA樣本質(zhì)量控制往往關(guān)注濃度、純度和完整度3個(gè)參數(shù)，其中前兩者可以用光密度(optical density，OD)260和OD260/280來表征，后者可以用RNA完整度(RNA integrity number，RIN)值來衡量。由于OD260/280對于RNA純度的評價(jià)尚無明確標(biāo)準(zhǔn)，故僅對RNA的濃度和完整度展開探討。按照ISO/IEC 17025∶2005的要求，從精密度、準(zhǔn)確度和線性3個(gè)方面，對RNA定量進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。由于缺乏測量RIN值測定的標(biāo)準(zhǔn)品，RNA完整度的方法學(xué)驗(yàn)證僅限于精密度的考察。結(jié)果選用的微量紫外分光光度法對RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，精密度、準(zhǔn)確度和線性均達(dá)到要求；Agilent 2100的RIN值系統(tǒng)對人Hela細(xì)胞來源的總RNA進(jìn)行了評價(jià)，RIN值的精密度也通過了考察。結(jié)論微量紫外分光光度法和Agilent 2100的RIN值系統(tǒng)可以作為RNA樣本質(zhì)量控制的方法。

質(zhì)量管理體系；方法學(xué)驗(yàn)證；精密度；準(zhǔn)確度；線性

為了提供高質(zhì)量的生物樣本及相關(guān)信息，生物樣本庫已經(jīng)成為連接臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究的橋梁[1]。生物樣本庫作為專業(yè)性的基礎(chǔ)設(shè)施，需要建立一整套良好的操作流程來管理人類樣本資源，這在全球范圍內(nèi)已達(dá)成共識。標(biāo)準(zhǔn)化和協(xié)調(diào)一致，是生物樣本庫組織的主旋律[2]。

2008年，法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會出臺了NF S 96-9000，這是第1個(gè)專門針對生物樣本庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立在經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織的推薦規(guī)范和ISO 9001∶2000的基礎(chǔ)之上。至今為止，還沒有特異性針對生物樣本庫的國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，可供生物樣本庫參考的國際文件層出不窮。如美國病理學(xué)家協(xié)會發(fā)布的樣本庫認(rèn)可項(xiàng)目，生物與環(huán)境樣本庫協(xié)會(International Society for Biological and Environmental Repositories，ISBER)發(fā)布的《2012樣本庫最佳實(shí)踐規(guī)范》(2012BestPracticesforRepo-sitories)，ISO 9001∶2000、ISO/IEC 17025∶2005和ISO Guide 34∶2000[4]。上海醫(yī)藥臨床研究中心接受上海市科學(xué)委員會委托，建設(shè)上海市生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)模型[5]；同樣，中心也發(fā)布了自己的最佳實(shí)踐規(guī)范，包括幾百項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和生物分析方法。

從生物樣本中提取RNA，如全血、白膜層，仍然被認(rèn)為是下游分析方法的必要前導(dǎo)環(huán)節(jié)之一。這些下游分析方法往往依賴高質(zhì)量的RNA?？煽康腞NA定量對于許多分子生物學(xué)應(yīng)用至關(guān)重要。RNA定量的不準(zhǔn)確，完整度低下，可能會對下游分析結(jié)果產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響。早在1987年，科學(xué)家們已經(jīng)充分認(rèn)識到采用經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法進(jìn)行生物學(xué)研究的重要性[6]。然而，生物樣本研究相關(guān)的RNA分析的質(zhì)控方法還沒有被完整的描述。一般而言，DNA質(zhì)控項(xiàng)目由分析質(zhì)控和功能質(zhì)控組成，包括濃度、純度、完整度和聚合酶鏈反應(yīng)成功率[7]，RNA質(zhì)控可以一并借鑒。在本項(xiàng)工作中，根據(jù)ISO/IEC 17025∶2005中5.9的要求，選擇分光光度法對RNA質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，用微流控芯片的方法對RNA完整度進(jìn)行評價(jià)。本項(xiàng)工作對上海生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)的最佳實(shí)踐規(guī)范有一定的借鑒意義，也為潛在的質(zhì)控項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的制定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) Ambion?RNA Control 250(商品編號：AM7155)，購自美國Life Technologies公司，批號：13030291，標(biāo)準(zhǔn)值：255 ng/μL，包裝：2×20 μL，儲存溫度：-20 ℃。

1.2 分光光度計(jì) 由ISBER和盧森堡國家樣本庫合作組織的全球能力比對項(xiàng)目中，對于RNA的質(zhì)量濃度和純度的計(jì)量提供了多種可選的方法，由參與該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自己的實(shí)際情況自行選擇。本項(xiàng)工作中，選擇了分光光度法進(jìn)行所有的RNA定量工作，以NanoDrop 2000分光光度儀為分析平臺。

1.3 微流控芯片法 RNA的完整度評價(jià)采用RNA完整度(RNA integrity number，RIN)值系統(tǒng)，設(shè)備平臺為Aglient 2100。

1.4 方法驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)分光光度法是否可以勝任其預(yù)期的目標(biāo),對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證方案的制訂，參考了美國食品和藥品管理局、國際協(xié)調(diào)會議以及美國藥典提供的規(guī)范。雖然此類研究的執(zhí)行有一個(gè)總體的框架，但是具體執(zhí)行時(shí)又存在著案例差異性[8]。

1.4.1 RNA的定量 定量的方法學(xué)驗(yàn)證方案包括精密度、準(zhǔn)確度和線性3個(gè)指標(biāo)。

1.4.1.1 精密度 精密度的評估往往通過批內(nèi)和批間的差異測試來實(shí)現(xiàn)。批內(nèi)測試一直被認(rèn)為是在最優(yōu)條件下精密度測量。然而，批間測試或許是精密度的更優(yōu)表現(xiàn)形式[9]，由于RNA的易降解性，不適合進(jìn)行批間實(shí)驗(yàn)。RNA定量的方法學(xué)驗(yàn)證方案：選用Ambion?RNA Control 250為目標(biāo)檢測物，在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度分別進(jìn)行重復(fù)檢測。NanoDrop 2000平臺選擇127.5 ng/μL 和25.5 ng/μL 2個(gè)質(zhì)量濃度。由于精密度是圍繞一個(gè)中心值的變異概念，實(shí)際上直接測量得到的是不精密度。對于一個(gè)正態(tài)分布而言，不精密度往往由標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，s)來表征[10]。

批內(nèi)分析：在不同質(zhì)量濃度水平，對RNA進(jìn)行20次重復(fù)定量檢測。

測量值的數(shù)據(jù)分析按照如下公式進(jìn)行:

(1)

(2)

變異系數(shù)(coefficientofvariation，CV)定義為：

(3)

本項(xiàng)工作中，CV≤10%認(rèn)為是可以接受的[11]。

批內(nèi)不精密度計(jì)算按照如下公式進(jìn)行：

(4)

(5)

計(jì)算公式：

(6)

(7)

1.4.2 數(shù)據(jù)的可接受性 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過Levey-Jennings質(zhì)控法的檢驗(yàn)[13]。

由于NanoDrop2000測定RNA和DNA的質(zhì)量濃度時(shí)，共享同一個(gè)光密度(opticaldensity，OD)260，室內(nèi)質(zhì)控沿用DNA室內(nèi)質(zhì)控方法[14]。

1.4.3RNA完整度評價(jià)RNA完整度評價(jià)在Agilent2100上進(jìn)行，指標(biāo)采用RIN值評價(jià)系統(tǒng)。選擇的檢測對象為提取自人Hela細(xì)胞的總RNA。細(xì)胞數(shù)量為1×107，提取方法為傳統(tǒng)的TRIzol方法。得到的總RNA，分高低2個(gè)質(zhì)量濃度，分別重復(fù)測定12次RIN值，求s及CV[參考公式(1)～(5)]，進(jìn)行RIN值精密度評價(jià)。由于無法獲取人總RNA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，RIN值準(zhǔn)確度無法進(jìn)行評價(jià)。

考慮到試劑成本，RNA室內(nèi)質(zhì)控參考DNA室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，DNA定量需要每月進(jìn)行室內(nèi)控制[14]。

2 結(jié)果

基于NanoDrop 2000分光光度儀平臺，制備了2種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為分析對象，用于精密度和準(zhǔn)確度分析的原始數(shù)據(jù)見表1。

表1 2種不同質(zhì)量濃度水平的批內(nèi)不精密度分析(ng/μL)

表2 2種質(zhì)量濃度水平下的不精密度CVw

表3 2種質(zhì)量濃度水平下的準(zhǔn)確度

線性分析的數(shù)據(jù)見表4。CVw值大于10%的數(shù)據(jù)舍棄不用。線性回歸相關(guān)系數(shù)r2為0.999 6(圖1)，符合線性要求。

表4 線性分析數(shù)據(jù)

圖1 NanoDrop 2000平臺上的線性分析

利用人Hela細(xì)胞獲得的總RNA質(zhì)量濃度為399 ng/μL，稀釋后得到109 ng/μL的低質(zhì)量濃度RNA樣本。對2種樣本進(jìn)行RIN值測定，分別重復(fù)12次，結(jié)果見表5、6，2種質(zhì)量濃度水平下CVw小于10%。

表5 2種質(zhì)量濃度水平下的RIN值

表6 2種質(zhì)量濃度水平下RIN值的不精密度CVw

3 討論

生物樣本庫的行業(yè)目標(biāo)是分析生物樣本，并將信息轉(zhuǎn)化為有序的數(shù)據(jù)，以服務(wù)于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。上海醫(yī)藥臨床研究中心已經(jīng)成為上海生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)的中樞。中心為了保證生物樣本及其信息的高質(zhì)量，引入了基于ISO/IEC17025∶2005的質(zhì)量管理體系。按照質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的原則，中心啟動了質(zhì)量控制項(xiàng)目，并開發(fā)了一整套生物樣本存儲和處理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

根據(jù)美國病理學(xué)家協(xié)會發(fā)布的《生物樣本庫認(rèn)證項(xiàng)目檢視清單》和ISBER頒布的《2012生物樣本庫最佳實(shí)踐規(guī)范》，在樣本的收集、儲存、檢索、出庫、檢測及銷毀過程中存在很多質(zhì)控點(diǎn)，這些樣本的質(zhì)量評估依賴于各種技術(shù)分析之后獲得的樣本數(shù)據(jù)[15-16]。然而，這些方法的方法學(xué)驗(yàn)證工作仍然是一片空白。

方法學(xué)驗(yàn)證目的是為了證明分析方法的可接受性。近幾年，為醫(yī)藥工業(yè)提供數(shù)據(jù)信息的生物分析方法快速發(fā)展?？偟膩碚f，方法學(xué)驗(yàn)證可以涵蓋特異性、準(zhǔn)確度、線性、偏差、精密度、檢測限、定量限和魯棒性[8]。但是，這樣的理念在生物樣本庫領(lǐng)域并未被廣泛接受。

后基因組時(shí)代，人們對RNA的研究得到廣泛開展。根據(jù)業(yè)內(nèi)廣泛達(dá)成的共識，本項(xiàng)工作對用于RNA定量的分光光度法進(jìn)行了簡單的方法學(xué)驗(yàn)證，包括精密度、準(zhǔn)確度和線性。數(shù)據(jù)顯示，3個(gè)參數(shù)均符合臨界值的要求。該結(jié)果暗示了分光光度法完全可以勝任RNA定量檢測。為了監(jiān)控檢測的有效性，并保證結(jié)果數(shù)據(jù)趨勢的可監(jiān)測性，按照Westgard多規(guī)則，使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。RIN值評價(jià)系統(tǒng)的精密度分析也得到了通過。

這個(gè)簡單的RNA定量和完整度的驗(yàn)證模型已經(jīng)成為上海生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)抽樣質(zhì)控項(xiàng)目的組成部分。目前，參與該抽樣質(zhì)控項(xiàng)目的醫(yī)院已經(jīng)達(dá)到12家。

本項(xiàng)工作完全按照業(yè)內(nèi)公認(rèn)的原則進(jìn)行，并嘗試將方法學(xué)驗(yàn)證的概念引入生物樣本庫領(lǐng)域。作者認(rèn)為本項(xiàng)工作仍然存在很多不足，如方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容比較簡單，僅選擇了3個(gè)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。換個(gè)角度考慮，檢測本身并不是關(guān)鍵，它可以很容易的被重復(fù)。但是，檢測是生物樣本價(jià)值的唯一釋放途徑，生物樣本最終的歸宿是轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)?？紤]到數(shù)據(jù)收集及挖掘?qū)俏磥砩飿颖編斓母呒壌嬖谛问?，在生物樣本庫運(yùn)營之初，建議所有分析方法經(jīng)過驗(yàn)證后方可使用，以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，為后續(xù)的數(shù)據(jù)挖掘打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]英昊，范錦立，甘榮興.國際人類生物資源中心的建設(shè)情況與發(fā)展趨勢[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92(23)：1648-1652.

[2]BetsouF,LuzerguesA,CarterA,etal.Towardsnormsforaccreditationofbiobanksforhumanhealthandmedicalresearch:compilationofexistingguidelinesintoanISOcertification/accreditationnorm-compatibleformat[J].QualityAssuranceJ,2007,11(3/4):221-294.

[3]HewittRE.Biobanking:thefoundationofpersonalizedmedicine[J].CurrOpinOncol，2011，23(1):112-119.

[4]YuilleM,IlligT,HveemK,etal.Laboratorymanagementofsamplesinbiobanks:Europeanconsensusexpertgroupreport[J].BiopreservBiobank，2010，8(1):65-69.

[5]Anon.ShanghaiBiobankNetwork(SBN)[J].BiopreservBiobank，2011，9(2):133.

[6]ShahVP.Analyticalmethodsusedinbioavailabilitystu-dies:aregulators[J].ClinResRegulAff，2008,5(1):51-60.

[7]PaltielL,AaremJ,BkkenS,etal.BiospecimenqualityprograminthebiobankoftheNorwegianInstituteofPublicHealth[J].NorEpidemiol，2012，21(2):225-229.

[8]GonzálezAG,HerradorMA.Apracticalguidetoanalyticalmethodvalidation,includingmeasurementuncertaintyandaccuracyprofiles[J].TrendsAnalytChem，2007，26(3):227-238.

[9]KarnesHT,ShiuG,ShahVP.Validationofbioanalyticalmethods[J].PharmRes,1991,8(4):421-426.

[10]ChesherD.Evaluatingassayprecision[J].ClinBiochemRev,2008,29Suppl1:S23-S26.

[11]MurrayA,LawrenceGP.Howshouldtherepeatabilityofclinicalmeasurementsbeanalysed?Anassessmentofanalysistechniqueswithdatafromcardiovascularautono-micfunctiontests[J].QJMed,1993,86(12):831-836.

[12]JohnsonR.Assessmentofbiaswithemphasisonmethodcomparison[J].ClinBiochemRev,2008,29Suppl1:S37-S42.

[13]LeveyS,JenningsER.Theuseofcontrolchartsintheclinicallaboratory[J].AmJClinPathol,1950,20(11):1059-1066.

[14]RuanL,SongY,FanJ,etal.TheShanghaibiobankingDNAqualitycontrolprogram[J].BiopreservBiobank,2014,12(4):259-264.

[15]ShabihkhaniM,LuceyGM,WeiB,etal.Theprocurement,storage,andqualityassuranceoffrozenbloodandtissuebiospecimensinpathology,biorepository,andbiobankse-ttings[J].ClinBiochem,2014,47(4/5):258-266.

[16]LouJJ,MirsadraeiL,SanchezDE,etal.Areviewofroomtemperaturestorageofbiospecimentissueandnucleicacidsforanatomicpathologylaboratoriesandbiorepositories[J].ClinBiochem,2014,47(4/5):267-273.

Method validation for RNA quality control in biobanking

RUANLiangliang1,ZHENGPeiyong2,YANGJiahong2,FANJinli1,GANRongxing1

(1.Shanghai Clinical Research Center, Shanghai 200233, China;2.Shanghai Hospital Development Center, Shanghai 200041, China)

Objective To perform method validation for RNA quality control. Methods There are three quality controls that are performed on isolated RNA: concentration, purity and integrity. The optical density (OD) at 260 nm is used to determine the RNA concentration in a solution. The ratio of the absorbance at 260 nm to 280 nm is used to assess the RNA purity of an RNA preparation. The integrity assessment is based on the RNA integrity number (RIN) system. In this work, we focused on the RNA concentration and integrity. According to the requirement of ISO/IEC 17025∶2005, the key factors of precision, accuracy and linearity testing were presented in assessing the method of RNA quantity. Precision testing on RNA integrity was also preformed. Results In this study, we focused on the validation of RNA quantitation by spectrophotometry, and performed precision, accuracy and linearity assessment. Total RNA from Hela cells was used for precision testing on RNA integrity. All the data were acceptable. Conclusion The method of spectrophotometry and RIN system are qualified for RNA quality control.

Quality management system; Method validation; Precision; Accuracy; Linearity

上海市科委研發(fā)項(xiàng)目資助(12DZ2294903，10DZ2251800)

200233 上海，上海醫(yī)藥臨床研究中心(阮亮亮，范錦立，甘榮興)；200041 上海，上海申康醫(yī)院發(fā)展中心(鄭培永，楊佳泓)

鄭培永，E-mail：zpychina@sina.com

R-05

A

2095-3097(2015)03-0161-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.009

2015-02-18 本文編輯：徐海琴)