龐春英， 陸杏蓉， 朱 鵬， 鄧廷賢， 段安琴， 陳明棠， 楊炳壯， 梁賢威

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

水牛具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫高濕、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、使用年限長(zhǎng)、靜默發(fā)情、繁殖力低和產(chǎn)奶量低等生物學(xué)特點(diǎn)，非常適合于中國(guó)南方農(nóng)村飼養(yǎng)［1-2］。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)2013年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2011年底中國(guó)水牛存欄量達(dá)2.338 2×107頭，僅次于印度的1.129 16×108頭和巴基斯坦的3.172 6×107頭，位居世界第3。水牛在中國(guó)畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，是重要的肉、乳和役兼用畜種資源，水牛奶更有“奶中之王”之稱。但是，當(dāng)前繁殖力低是制約水牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。水牛性成熟晚，屬季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，產(chǎn)后卵巢長(zhǎng)時(shí)間不活動(dòng)，發(fā)情癥狀不明顯，懷孕率低，各地調(diào)查的繁殖率為30%～60%;通過超數(shù)排卵結(jié)合活體采卵技術(shù)(O-vum pick up，OPU)每個(gè)水牛卵巢可以獲得2.25枚卵母細(xì)胞［3-4］，而黃牛平均卵母細(xì)胞數(shù)則高達(dá)30.84±0.88枚［5］。因此，深入闡明水牛繁殖調(diào)控的機(jī)理，了解其卵泡發(fā)生模式，尤其是關(guān)鍵基因的表達(dá)和作用方式，對(duì)于提高水牛的繁殖力具有重要意義，但是當(dāng)前關(guān)于水牛繁殖分子機(jī)制的研究較少［6-10］。

透明帶蛋白對(duì)于脊椎動(dòng)物的精卵識(shí)別、多精受精的防控以及胚胎的保護(hù)起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。透明帶蛋白家族，由透明帶蛋白1(Zona pellucida 1，ZP1)、透明帶蛋白2(Zona pellucida 2，ZP2)、透明帶蛋白3(Zona pellucida 3，ZP3)和透明帶蛋白4(Zona pellucida 4，ZP4)組成。小鼠的透明帶由ZP1～ZP3組成，其中ZP3蛋白是小鼠主要的精子受體，能夠誘發(fā)小鼠精子的頂體反應(yīng)［11］。人的透明帶由ZP1～ZP4組成，其中ZP1、ZP3和ZP4與精子結(jié)合并誘發(fā)頂體反應(yīng)［12］。豬和牛的透明帶由ZP2、ZP3和ZP4組成，其中ZP3與ZP4形成異源二聚體，然后與精子結(jié)合［13］。ZP3基因特異表達(dá)于動(dòng)物的初級(jí)卵母細(xì)胞中［14］，已被成熟地應(yīng)用于基因的時(shí)空特異性敲除［15］。但當(dāng)前關(guān)于水牛ZP3基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究較少，鑒于此，本研究旨在克隆水牛ZP3基因5′側(cè)翼序列，對(duì)其序列特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建pZP3-EGFP-1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞和CHO細(xì)胞，分析ZP3啟動(dòng)子的組織表達(dá)特異性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用水牛選自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所水牛養(yǎng)殖基地。

1.2 主要試劑

水牛血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DH5a感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技有限公司，去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，LA Taq酶、BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶、pMDl8-T Vector均購(gòu)自大連TaKaRa公司，T4連接酶購(gòu)自Fermentas公司，DMEM高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(FBS，Hyclone)、胰酶和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Life 3000，Invitrogen)等購(gòu)自Life公司。倒置熒光顯微鏡(Nikon)、0.22 μm過濾器(Millipore)、其他試劑無(wú)特殊說明的均購(gòu)自Sigma公司。試驗(yàn)所用載體、細(xì)胞均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 以奶牛ZP3基因序列(DQ489319.1)為參考，進(jìn)行同源比對(duì)，根據(jù)In-Fusion引物設(shè)計(jì)特點(diǎn)，應(yīng)用Oligo 6.0軟件針對(duì)ZP3的同源保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，擴(kuò)增ZP3基因5′端3 081 bp。引物 ZP3-F序列為5′-CTCAAGCTTCGAATTCTCTAGACAACCCCACCCTACTCCCAG-3′，ZP3-R序列為5′-CATGGTGGCGACCGGTCGGTGCCGAAAAGGTCTTTG-3′，下劃線處為In-Fusion引物同源區(qū)域，退火溫度為55℃。

1.3.2 水牛血液基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增按照血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit操作說明書提取水?；蚪MDNA。PCR反應(yīng)體系20 μl:模板1 μl，上、下游引物(各20 μmol/L)各1 μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)10 μl，ddH2O補(bǔ)至20 μl。PCR反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收并進(jìn)行TA克隆。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)沼澤型水牛ZP3測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源序列比對(duì)，用MEGA5.0軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹構(gòu)建，用Promoter (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml? topic=fprom＆group=programs＆subgroup=promoter)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子，用Gpminer(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子，用Jaspar(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl? rm=browse＆db=core＆tax_group=vertebrates)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子，用Methprimer(http://www.urogene.org/ cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測(cè)CpG島。

1.3.4 載體構(gòu)建 應(yīng)用Bgl II和Age I雙酶切骨架載體pEGFP-1，酶切體系及方法參照試劑說明書。酶切3 h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠回收，并于4℃保存用于后續(xù)In-Fusion連接。In-Fusion連接體系:5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μl，PCR膠回收產(chǎn)物6 μl，線性化骨架載體2 μl。反應(yīng)條件為:50℃15 min，之后4℃保存。轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、去內(nèi)毒質(zhì)粒提取等嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行。重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HEK-293T和CHO細(xì)胞系用含有10%進(jìn)口胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2濃度下培養(yǎng)，隔天傳代。轉(zhuǎn)染按照Life 3000轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說明書進(jìn)行。48 h后在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛ZP3基因的克隆與鑒定

以水牛血液基因組為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增ZP3基因，經(jīng)PCR成功擴(kuò)增獲得3 081 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 水牛ZP3基因的擴(kuò)增與亞克隆Fig.1 Amplification and subcloning of buffalo ZP3 gene

2.2 水牛ZP3基因序列分析

對(duì)獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，獲得水牛ZP3基因序列。應(yīng)用NCBI的BLAST軟件進(jìn)行相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，廣西本地水牛ZP3核酸序列與河流型水牛、黃牛、綿羊和山羊的相似性分別為99%、96%、92%和92%，表明ZP3基因在不同哺乳動(dòng)物中具有較高的序列保守性。

2.3 水牛ZP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

選擇所克隆得到的廣西本地水牛ZP3基因序列與黃牛、小鼠和人相關(guān)序列進(jìn)行多重序列比較，結(jié)果表明廣西本地水牛ZP3基因序列與黃牛具有較高的相似性，與小鼠和人的序列差別較大。進(jìn)一步應(yīng)用MEGA5.0軟件，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。由圖2可知，水牛與黃牛的相應(yīng)序列聚為一支，與綿羊的遺傳距離相對(duì)較近，進(jìn)化樹的形態(tài)與分類學(xué)具有較高的一致性，進(jìn)一步說明克隆的序列為水牛ZP3基因。

2.4 水牛ZP3基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的生物信息分析

選取廣西本地水牛ZP3基因5′側(cè)翼2 000 bp序列，進(jìn)行啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子反式作用元件等分析。Gpminer在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在-147 bp至-196 bp區(qū)域存在啟動(dòng)子特征序列(TATA box)，序列為 TCATCAGGGGTATAAGACGGTGGGTGGTGCCTGCCCAGGAGTCACAGTGG。經(jīng)Jaspar和Gpminer軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)本地水牛ZP3基因5′側(cè)翼序列2 000 bp內(nèi)存在2個(gè)潛在核心啟動(dòng)子區(qū)，其中一處為-50 bp至-409 bp區(qū)域，此區(qū)域存在 TBP(-187 bp……-173 bp)、SP1(-60 bp……-50 bp)、CEBPA (-409 bp……-399 bp)和USF1，2(-126 bp……-116 bp)等結(jié)合位點(diǎn)，分別結(jié)合 TATA box、GC box、CAAT box和 E box;另一處為 -1 031 bp至-1 248 bp處，此區(qū)域存在TBP(-1 069 bp……-1 031 bp)、SP1(-1 248 bp…… -1 226 bp)、CEBPA(-1 122 bp…… -1 112 bp)和 USF1，2 (-1 105 bp……-1 095 bp)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。此外在廣西本地水牛ZP3基因5′側(cè)翼序列2 000 bp內(nèi)，也存在Foxo3、Nobox、Stat3、Stat5a、Stat5b、Stat6、YY1和Gata家族等反式作用元件結(jié)合位點(diǎn)，其中Stat家族基因在ZP3基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且ZP3同一位點(diǎn)處存在多個(gè)Stat家族基因結(jié)合的情況(圖3、圖4、圖5)。通過Methprimer預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在ZP3基因翻譯起始位點(diǎn)上游不存在CpG島。

圖2 水牛與其他物種ZP3基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZP3 gene among buffalo and other species based on nucleotide sequence

圖3 水牛ZP3基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the promoter of buffalo ZP3 gene

2.5 pZP3-EGFP-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄活性檢驗(yàn)

應(yīng)用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建pZP3-EGFP-1真核表達(dá)載體，電泳及測(cè)序結(jié)果表明所構(gòu)建載體正確(圖1)。應(yīng)用脂質(zhì)體Life 3000，將陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFPN1轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細(xì)胞系，陰性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-1轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細(xì)胞系，所構(gòu)建的pZP3-EGFP-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細(xì)胞系，48 h后進(jìn)行熒光觀察。結(jié)果表明:陽(yáng)性對(duì)照載體pEGFPN1在HEK-293T和CHO細(xì)胞系中有EGFP蛋白表達(dá)，且在HEK-293T中熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于CHO細(xì)胞系;陰性對(duì)照載體pEGFP-1在HEK-293T和CHO細(xì)胞系中均無(wú)EGFP蛋白表達(dá);試驗(yàn)載體pZP3-EGFP-1在HEK-293T細(xì)胞系中無(wú)EGFP蛋白表達(dá)，在CHO細(xì)胞系中有EGFP蛋白表 達(dá)(圖6)。

圖4 水牛ZP3基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)Fig.4 The prediction of transcription factor of buffalo ZP3 promoter

圖6 水牛ZP3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性Fig.6 The transcriptional activity of promoter of buffalo ZP3 gene

3 討論

小鼠透明帶由ZP1、ZP2和ZP3 3種糖蛋白組成，三者的含量比值為1∶4∶4［16］。其中ZP3基因特異表達(dá)于初級(jí)卵泡階段及其之后的卵母細(xì)胞中［17］。ZP3的缺失，一方面致使透明帶不能形成，另一方面致使胚胎發(fā)育不能躍過2細(xì)胞期［18］。人的ZP3基因位于7號(hào)染色體上，含有7個(gè)可變剪切體，其中4個(gè)可以編碼蛋白質(zhì)，分別編碼373 aa、424 aa、248 aa和258 aa。編碼區(qū)最長(zhǎng)的可變剪切體含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。小鼠的ZP3基因位于5號(hào)染色體上，含有2個(gè)可變剪切體，僅有1個(gè)可以編碼蛋白質(zhì)，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。黃牛的ZP3基因位于25號(hào)染色體上，編碼421 aa。對(duì)透明帶基因表達(dá)調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，位于透明帶蛋白質(zhì)翻譯起始位點(diǎn)上游 200bp處存在 E-box (CANNTG)，能夠與反式作用因子Figla和USF1等結(jié)合，從而促進(jìn)透明帶蛋白質(zhì)基因的表達(dá)［19］。Shi等［20］研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚的ZP1、ZP2和ZP3基因聚集在一起，其跨度為10 855 bp，其中ZP2和ZP3間的1 097 bp具有雙向啟動(dòng)子的特性，能夠同時(shí)調(diào)節(jié)ZP2和ZP3基因的表達(dá)。本研究成功克隆獲得沼澤型水牛ZP3 5′側(cè)翼序列及部分外顯子序列，共3 081 bp，同源性分析結(jié)果表明其與河流型水牛和黃牛的序列相似性較高。

本研究通過信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在水牛ZP3啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)存在2個(gè)潛在核心啟動(dòng)子區(qū)，其中一處為-50 bp至-409 bp區(qū)域，此區(qū)域存在 TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等結(jié)合位點(diǎn)，與文獻(xiàn)［21］報(bào)道的一致;另一處為-1 031 bp至-1 248 bp處，此區(qū)域存在TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。此外還存在 GATAs、Foxo1、Foxo3、Stats和YY1等反式作用元件結(jié)合位點(diǎn)，且存在Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b以及Stat6同時(shí)結(jié)合的位點(diǎn)，提示Stats可能通過形成二聚體的形式調(diào)控ZP3的表達(dá)。通過構(gòu)建pZP3-EGFP-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ZP3 5′側(cè)翼序列能夠啟動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)于 CHO細(xì)胞中，但不能啟動(dòng)其表達(dá)于HEK-293T細(xì)胞中，表明所克隆獲得的沼澤型水牛ZP3 5′側(cè)翼序列具有組織表達(dá)特異性?？傊?，本研究成功克隆了廣西本地水牛ZP3 5′側(cè)翼區(qū)域，并驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)錄活性，但對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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