陳 飛， 李 蕾， 周佳宇， 戴傳超

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心/江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點實驗室，江蘇南京210023)

茅蒼術(shù)(Atractylodes lancea)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，是中國重要的藥用植物，主要分布于江蘇、湖北和河南等省份，而江蘇茅山一帶是茅蒼術(shù)道地藥材的產(chǎn)區(qū)。茅蒼術(shù)根莖是著名的道地藥材，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效。近年來國內(nèi)外學(xué)者對茅蒼術(shù)的研究日趨深入，尤其是對其揮發(fā)油的化學(xué)成分進行了大量的研究。茅蒼術(shù)揮發(fā)油中主要為倍半萜類的蒼術(shù)酮、β-桉葉醇和茅術(shù)醇及聚乙炔類的蒼術(shù)素。茅蒼術(shù)的道地性則主要表現(xiàn)為揮發(fā)油中各成分呈現(xiàn)出特定配比關(guān)系，道地產(chǎn)區(qū)蒼術(shù)揮發(fā)油含量較非道地產(chǎn)區(qū)低而蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素高于非道地產(chǎn)區(qū)［1］。由于道地藥材成分的特殊性，野生茅蒼術(shù)資源的嚴重破壞，加上茅蒼術(shù)體內(nèi)豐富的內(nèi)生真菌資源［2］，因此利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)道地性藥材被視為解決茅蒼術(shù)資源短缺問題的一條有效途徑。本課題組之前的研究結(jié)果表明，在懸浮細胞水平，添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子可以使β-桉葉醇有效轉(zhuǎn)化為蒼術(shù)酮、茅術(shù)醇和蒼術(shù)素［3］;組培苗水平下添加內(nèi)生真菌小菌核菌AL3、小克銀漢霉AL4和孔球孢霉AL12均可提高蒼術(shù)酮相對含量而降低β-桉葉醇含量［4］。

內(nèi)生真菌能與宿主建立穩(wěn)定共生關(guān)系，并賦予宿主一些優(yōu)良的性狀，如促進植物生長，增強植物對不良環(huán)境的抗性，抗病蟲害，促進植物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等［5-9］。宿主植物也能通過產(chǎn)生相關(guān)防御酶系(幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶)水解真菌細胞壁抑制真菌的生長［10］，說明內(nèi)生真菌能激發(fā)宿主的防御反應(yīng)，但這種反應(yīng)相比于病原菌侵染是溫和的［11］。內(nèi)生菌與病原菌之間的轉(zhuǎn)變是一個連續(xù)的過程，二者的平衡一旦被打破，植物就會顯現(xiàn)出病征［12］。

揮發(fā)油作為植物組成型次生代謝產(chǎn)物是一種進化形成的抵抗外界病原物的機制。病原菌為了成功侵染植物分泌解毒酶分解利用次級代謝產(chǎn)物以克服植物的防御系統(tǒng)［13］。內(nèi)生真菌能夠從體外侵入植株，本身就具有植物病原菌的某些特性，因此內(nèi)生真菌也有類似的分解利用次級代謝產(chǎn)物的機制。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌生赤殼屬Bionectria ochroleuca ALG-13可利用揮發(fā)油為唯一碳源［14］，并增加道地成分(蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素)相對含量而降低非道地成分(β-桉葉醇和茅術(shù)醇)相對含量。但是茅蒼術(shù)揮發(fā)油有很強的抑菌活性，內(nèi)生真菌如何與這種抑菌物質(zhì)達成平衡不使植物致死，同時使自身生長受到植物調(diào)節(jié)的拮抗平衡機制還沒有系統(tǒng)的研究。目前，尚沒有文獻報道植物次級代謝產(chǎn)物與其內(nèi)生真菌、病原真菌建立拮抗平衡過程的區(qū)別。本研究擬通過茅蒼術(shù)揮發(fā)油及各組分對其內(nèi)生真菌和病原真菌抑菌活性的研究，以期發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油對內(nèi)生真菌、病原真菌不同的抑制作用，并試圖找出宿主植物與內(nèi)生真菌建立拮抗平衡的關(guān)鍵物質(zhì)，從而更好地理解內(nèi)生真菌與宿主植物之間拮抗平衡的共生關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茅蒼術(shù)根莖購于陜西地道藥材有限公司。病原真菌選擇茅蒼術(shù)3種常見的病原菌:尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和茅蒼術(shù)黑斑病病菌交鏈孢(Alternaria solani)，以上菌株由本實驗室分離保存。內(nèi)生真菌選擇課題組從茅蒼術(shù)中篩選出的2株內(nèi)生真菌:菌株AL11，為鐮刀菌屬(Fusariium sp.);菌株AL12，為孔球孢霉屬(Gilmaniella sp.)。

1.2 試驗方法

1.2.1 茅蒼術(shù)揮發(fā)油及其主要組分的制備 將茅蒼術(shù)根打碎成粉末狀，稱取1 000 g的粉末，加適量水，用水蒸氣蒸餾法提取，得到蒸餾液和殘渣。把殘渣重新提取2次，濃縮濾液，加適量乙醇，把蒸餾液和濾液混合，用乙醚萃取2次。萃取液自然揮發(fā)干燥，即得黃棕色半固體狀，具有特殊濃郁香味的揮發(fā)油。揮發(fā)油4種主要組分由本課題組分離制備［15］。

1.2.2 菌株活化及菌懸液制備 將所有供試菌株分別挑取小塊，于PDA試管斜面中，28℃培養(yǎng)48 h，加入無菌水，刮取菌絲體制成初始菌懸液。取適量菌懸液，加入無菌水，將其稀釋成含菌(孢子)量1×107～1×108CFU/ml的菌懸液備用。

1.2.3 真菌抑制率及IC50測定 稱取2.5 g揮發(fā)油，加入5%(體積比)吐溫20，用滅菌蒸餾水定容至50 ml作為母液，分別吸取母液25 μl、50 μl、100 μl、200 μl、400 μl、600 μl、800 μl、1 600 μl加入8支10 ml的容量瓶中，用無菌蒸餾水定容，得到125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml、2 000 μg/ml、4 000 μg/ml、6 000 μg/ml和8 000 μg/ml的8個濃度。采用生長速率法，取1 ml藥液，加入9 ml已經(jīng)熔化的PDA培養(yǎng)基混勻，迅速倒入9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，藥劑濃度相應(yīng)縮小10倍，在培養(yǎng)皿中央相應(yīng)放入直徑為0.5 cm的菌餅一塊，無菌蒸餾水加等量吐溫20為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)對照組菌絲生長至平板邊緣，取出平板計算抑制率。抑制率(%)=(CT)/T×100%(C:對照組真菌菌絲直徑;T:不同處理組下真菌菌絲直徑)。半抑制濃度IC50則根據(jù)真菌抑制率和抑制濃度對數(shù)的關(guān)系計算得出［16］。

1.2.4 揮發(fā)油及各組分抑菌活性的測定 將無菌濾紙片(直徑6 mm，高壓蒸氣滅菌后烘干)浸泡在揮發(fā)油及各組分中30 min，在平皿邊緣將濾紙片上多余液體瀝干，貼于涂布孢子懸液的PDA平板上，28℃培養(yǎng)48 h。以平板中貼有乙酸乙酯的濾紙片為空白對照。48 h后記錄形成的抑菌圈大小。每組試驗設(shè)3個重復(fù)，試驗結(jié)果取平均值。

1.2.5 病原菌孢子萌發(fā)率測定 采用懸滴法，將揮發(fā)油和各組分分別添加到含5 ml PDA的試管中得終濃度為0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml，同時每管中添加100 μl的孢子懸液(每1 ml 1×107個孢子)。28℃培養(yǎng)，6 h后鏡檢(每個重復(fù)檢查孢子數(shù)100個以上)，之后隔2 h鏡檢1次，記錄各處理組孢子萌發(fā)個數(shù)和檢查孢子總數(shù)，計算孢子萌發(fā)率(%)=孢子萌發(fā)個數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%。

1.2.6 蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對菌絲分支的影響 用接種針挑取蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素處理的菌落邊緣菌絲分別制片，觀察不同處理下菌絲體生長情況、菌絲直徑和主菌絲上相鄰分支菌絲間的距離(μm)，每個處理隨機挑取12個視野，統(tǒng)計菌絲粗細和菌絲分支間距［17］。圖像采用MetaMorph/MetaFluor軟件(West Chester)分析，菌絲形態(tài)拍攝采用 Sensicam QE Cooled Digital Camera System(Cooke Corp)。將蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml和0.5 mg/ml 5個濃度，分別吸取上述溶液10 μl與受試菌孢子懸液10 μl置于3 ml的PDA試管中，10 μl乙酸乙酯為空白對照，28℃培養(yǎng)，3個重復(fù)。2 h后鏡檢(每個重復(fù)檢查孢子數(shù)100個以上)，之后隔2 h檢查一次，待對照孢子萌發(fā)率達80%以上時計算孢子萌發(fā)率。

1.2.7 掃描電鏡(SEM)觀察蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對真菌的影響 在含有蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素的PDA平板上分別接種AL11和交鏈孢，對照組添加相同含量乙酸乙酯，28℃培養(yǎng)72 h，在菌落邊緣取5～10 mm見方的菌塊，雙蒸水洗滌30 min，然后浸泡于2.5%戊二醇(pH 7.4)中4℃固定過夜。固定好的樣品再用磷酸緩沖液(pH 7.4)洗滌30 min。用1%鋨酸室溫固定2 h后磷酸緩沖液洗滌 30 min。再用系列梯度為3%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，其中100%乙醇的脫水時間為30 min，其他梯度乙醇的脫水時間均為20 min。脫水后的菌絲冷凍真空干燥1 h，最后鍍膜。在加速電壓 15 kV的條件下用掃描電鏡(Vantage VJSM-5610LV)觀察菌絲形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析揮發(fā)油及各組分對供試菌抑制效率，不同組分下菌絲分支間距等，采用S-N-K方差分析差異顯著性，數(shù)據(jù)均以平均數(shù) ±方差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茅蒼術(shù)揮發(fā)油對各供試真菌的抑制作用

利用平板生長速率法測定揮發(fā)油對3種病原真菌、2種內(nèi)生真菌的抑制率。由圖1可知，隨著揮發(fā)油濃度增加，其對真菌的抑制率逐漸提高，在低濃度(12.5 μg/ml和25.0 μg/ml)下，腐皮鐮刀菌和交鏈孢的生長抑制大于AL12。當(dāng)揮發(fā)油濃度增加到200 μg/ml以上時，3種病原真菌受抑制程度均大于2種內(nèi)生真菌，表明高濃度揮發(fā)油雖然可在一定程度上抑制內(nèi)生真菌的生長，但其對于病原真菌的抑制作用更強烈。當(dāng)揮發(fā)油濃度為800 μg/ml時，交鏈孢、腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌的抑制率分別達到77.56%、71.75% 和70.07%，而AL11和AL12的抑制率分別為61.90%和23.57%。

揮發(fā)油對各供試菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果(表1)表明，揮發(fā)油對交鏈孢、腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、AL11和AL12菌絲的生長抑制活性依次降低。揮發(fā)油對病原真菌中的茅蒼術(shù)自身病原菌交鏈孢的毒力最強，其 IC50最低，為159.050 9 μg/ml，而對內(nèi)生真菌AL11和AL12的毒力都明顯低于所有病原菌，IC50分別為422.766 1 μg/ml、782.039 3 μg/ml。

圖1 不同濃度揮發(fā)油對供試真菌菌絲的抑制率Fig.1 Growth inhibitory effect of Atractylodes lancea volatile oil on tested strains

表1 揮發(fā)油對供試真菌生長毒力分析Table 1 The virulence of A.lancea volatile oil to tested strains

通過平板濾紙片擴散法測定揮發(fā)油及各組分對3種病原真菌、2種內(nèi)生真菌的抑菌圈直徑。從表2可以看出，揮發(fā)油對5種供試菌均可形成抑菌圈。β-桉葉醇和茅術(shù)醇濾紙片對5種供試真菌均未形成抑菌圈，菌落緊貼濾紙片邊緣。蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對交鏈孢、腐皮鐮刀菌形成的抑菌圈直徑大于尖孢鐮刀菌，蒼術(shù)酮對AL12無抑制作用，對AL11形成較小的抑菌圈。和蒼術(shù)酮相比，蒼術(shù)素對病原真菌、內(nèi)生真菌形成的抑菌圈直徑較大。

揮發(fā)油及其兩種組分蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對病原真菌都顯示出較強的抑菌效果，對內(nèi)生真菌的影響較小。這可能是內(nèi)生真菌適應(yīng)了宿主體內(nèi)高濃度揮發(fā)油的環(huán)境，而這種適應(yīng)能力在更高濃度的揮發(fā)油2種組分蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素的脅迫下會在一定程度上被破壞，從而顯示出一定程度的抑制。揮發(fā)油和各組分對尖孢鐮刀菌的次級代謝物的產(chǎn)生有抑制能力，尖孢鐮刀菌試驗組對照培養(yǎng)基中初始菌落為白色，1 d后迅速產(chǎn)生紫色的代謝物，而添加揮發(fā)油和各組分后，2 d后才產(chǎn)生紫色代謝物且顏色較對照組淺。

2.2 揮發(fā)油各組分對病原真菌孢子萌發(fā)的影響

既然β-桉葉醇和茅術(shù)醇對內(nèi)生真菌、病原真菌均無抑制作用，說明蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素可能是茅蒼術(shù)與其內(nèi)生真菌建立拮抗平衡的關(guān)鍵物質(zhì)，因此后續(xù)試驗有必要以蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素為材料進一步具體考察其對病原真菌和內(nèi)生真菌的影響。由表3可知，當(dāng)蒼術(shù)素濃度為0.1 mg/ml時，交鏈孢和尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)率分別為56.69%和70.64%，與對照有顯著差異，而腐皮鐮刀菌在蒼術(shù)素濃度達到0.3 mg/ml時才受到顯著影響，此時其孢子萌發(fā)率降至75.27%。當(dāng)蒼術(shù)酮濃度為0.2 mg/ml時，交鏈孢和尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)率才顯著降低，分別為33.44%和66.92%，腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)率在蒼術(shù)酮濃度為0.5 mg/ml時才受到影響，為69.94%。綜合分析，蒼術(shù)素對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制效果大于蒼術(shù)酮，并且對于交鏈孢、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)率的影響呈依次降低趨勢。

表2 茅蒼術(shù)揮發(fā)油及各組分對供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameters of A.lancea volatile oil and its components to tested strains

表3 蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對供試菌孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effect of different concentrations of atractylon and atractydin on sporulation of tested strains

2.3 蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素對供試菌菌絲形態(tài)的影響

在添加蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素的PDA培養(yǎng)基上，以5種供試菌作為試驗材料，顯微觀察(×20)其菌絲生長情況。交鏈孢、AL11和AL12的菌絲分支增多(圖2)，菌絲分支間距離明顯變短，而對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的菌絲分支影響不明顯(表4)。從圖2可以看出，在0.2 mg/ml的蒼術(shù)酮和0.1 mg/ml的蒼術(shù)素條件下，內(nèi)生真菌AL11(圖2 A1，圖2 A2)和病原菌交鏈孢(圖2 B1，圖2 B2)的菌絲分支較其對照(圖2A，圖2B)多，分支間距離較短;但上述濃度的蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素處理的AL12的菌絲分支間距離(圖2C1、圖2C2)與對照(圖2C)相比并無顯著差異。

表4 不同揮發(fā)油組分下供試菌菌絲分支間距Table 4 Distance between hyphal branches of pathogenic fungi exposed to different components of volatile oil

以病原菌交鏈孢和內(nèi)生真菌AL11作為試驗材 料，掃描電鏡觀察其菌絲在蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素下生長情況。對照組中菌絲形態(tài)光滑，呈線狀(圖3E，3F)。蒼術(shù)酮處理交鏈孢后，菌絲異常斷裂(圖3A)或明顯斷痕(圖3B)導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)的流失;蒼術(shù)素處理后，交鏈孢菌絲表面有疣狀突起(圖3C)和菌絲異常褶皺(圖3D)。對于內(nèi)生真菌AL11，在蒼術(shù)酮試驗組中的菌絲與對照無顯著差異(圖3I)，而在蒼術(shù)素試驗組中菌絲表面也呈現(xiàn)類似的疣狀突起(圖3G)或者在菌絲表面有發(fā)皰現(xiàn)象(圖3H)。

圖2 蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素下菌絲生長情況Fig.2 Growth of hyphae exposed to atractlon and atractydin

圖3 蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素對供試真菌菌絲掃描電鏡結(jié)果Fig.3 Scanning electron microscopy of hyphae exposed to atractylon and atractydin

3 討論

由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)普遍存在，因而內(nèi)生菌與宿主植物之間的互作研究已經(jīng)成為教科書中微生物介導(dǎo)植物與草食動物之間關(guān)系的一種“模型”。內(nèi)生菌一般分為兩類，一類來源于種子，稱為垂直傳播型;另一類來源于外界隨機的感染，稱為水平傳播型［18］。大部分內(nèi)生菌屬于后者，和前者相比，后者增加了傳染性傳播的機會和毒力［19］，而宿主產(chǎn)生的次級代謝物是平衡內(nèi)生菌與宿主的關(guān)鍵物質(zhì)。根據(jù)傳播方式和生殖方式，內(nèi)生菌與植物關(guān)系從對抗進化為互惠共生［20］。這種互惠共生關(guān)系不僅表現(xiàn)為內(nèi)生菌促進宿主植物生長(生理生化指標(biāo)的提高)、次級代謝物的積累［21］，還表現(xiàn)在宿主受到生物脅迫時，內(nèi)生菌產(chǎn)生能抑制病原菌的物質(zhì)［22］。內(nèi)生菌擁有某些與病原菌相類似的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)都是引發(fā)植物排斥反應(yīng)的信號分子。內(nèi)生菌從體外侵入植物必然伴隨著植源性活躍誘導(dǎo)子的釋放，因此，內(nèi)生菌在長期進化中形成了克服宿主非特異性防御的機制維持自身在宿主體內(nèi)的生態(tài)位并保持宿主細胞完整性。雖然內(nèi)生菌能夠適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境，但宿主植物也通過某種機制嚴格限制內(nèi)生菌的生長，研究發(fā)現(xiàn)高濃度茅蒼術(shù)揮發(fā)油限制內(nèi)生真菌的生長，導(dǎo)致菌絲分支增多，菌絲生長減慢，氣生菌絲不發(fā)達［23］。

藥用植物產(chǎn)生的活性物質(zhì)通常具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等功效，其體內(nèi)的內(nèi)生真菌存在某種適應(yīng)機制以應(yīng)對植物體內(nèi)產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。茅蒼術(shù)揮發(fā)油是宿主植物代謝產(chǎn)生的限制內(nèi)生真菌過度生長的因子。本研究抑菌試驗發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)揮發(fā)油對于土傳病原真菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌均有良好的抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)與花生間作時，根系分泌的揮發(fā)油抑制了土壤病原菌的生長，促進有益微生物的生長從而提高了花生的產(chǎn)量［24］。揮發(fā)油4種主要成分中蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對病原真菌的孢子萌發(fā)有強烈抑制能力。Zhen等［25］發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮可以有效減緩由CCL4引起的小鼠肝中毒，Jeong等［26］的研究結(jié)果也表明蒼術(shù)酮對關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、呼吸道感染等疾病有一定的藥理活性。蒼術(shù)素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用［27］，但是對真菌的抑制作用鮮有文獻報道，我們首次發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油及其組分蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素對植物病原真菌有極強的抑制作用，可以應(yīng)用于對該病害的防治。病原真菌在含有蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素的培養(yǎng)基上生長導(dǎo)致菌絲褶皺、斷裂，可能是由于菌絲特定位點上囊泡的缺失引起，從而影響了病原菌胞吐過程［28］，阻斷了病原菌代謝，限制其生長。

茅蒼術(shù)揮發(fā)油對內(nèi)生真菌生長的限制作用弱于病原真菌，體外試驗結(jié)果證明茅蒼術(shù)揮發(fā)油對內(nèi)生真菌生長的抑制率較低，但蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素能導(dǎo)致內(nèi)生真菌菌絲分支增多，在一定程度上抑制菌體生長，這與課題組之前的研究結(jié)果［23］一致。說明內(nèi)生真菌在茅蒼術(shù)體內(nèi)生長受到蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素的抑制，蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素很可能是內(nèi)生真菌與宿主建立拮抗平衡的關(guān)鍵物質(zhì)。

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