俞潔瓊， 王洪成， 何正文， 樂易林， 邵蔚藍

(江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院/生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

中國農(nóng)作物秸稈資源極其豐富，在2009年其總產(chǎn)量已達到7×108t，其中主要是稻草和玉米秸稈，分別為2.5×108t和2.3×108t。然而每年約占總量13%～17%的秸稈被焚燒處理，這是造成近年來被高度關(guān)注的霧霾的直接原因之一。目前，秸稈再利用的主要途徑是秸稈還田和飼料化，而由于秸稈的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)特點，半纖維素與木質(zhì)素通過酯鍵形成緊密的外圍，阻礙飼用禽畜體內(nèi)消化酶與秸稈內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的接觸，影響禽畜的生長性能。木聚糖是半纖維素的主要成分，自然界儲量大，在被子植物中約占總干質(zhì)量的15%～30%，同時也是秸稈等飼料的一個主要的抗營養(yǎng)因子［1］。往秸稈飼料中投放能夠降解木聚糖的酶類，降低食糜粘度，可以有效地減少或消除木聚糖的抗營養(yǎng)作用［2-5］。秸稈木聚糖降解的傳統(tǒng)方法是使用物理和化學(xué)處理，相對而言，酶制劑的使用具有反應(yīng)高度特異性，反應(yīng)條件溫和，以及不會由于化學(xué)條件限制造成底物損耗以及環(huán)境問題等優(yōu)勢，因而受到越來越多的關(guān)注。同時木聚糖酶的投入還可以幫助實現(xiàn)秸稈在其他方面的清潔利用，如秸稈粗纖維造紙以及在食品行業(yè)中生產(chǎn)低聚木糖等。然而木聚糖酶活性在實際應(yīng)用中受到各方面的影響，例如飼料生產(chǎn)過程的高溫、動物腸道內(nèi)環(huán)境溫度等都會抑制其催化降解活性，因此供應(yīng)的木聚糖酶不僅要具有很高的熱穩(wěn)定性，其分解木聚糖反應(yīng)最適溫度也要接近動物腸道內(nèi)環(huán)境溫度，這樣才能減少損失和最大程度發(fā)揮它的催化作用。因此，適合實際應(yīng)用的木聚糖酶的研究與開發(fā)工作仍然十分緊迫。

棲熱菌是地?zé)岣邷鼐拇?，其產(chǎn)生的高溫酶由于擁有良好的熱穩(wěn)定性通常被開發(fā)應(yīng)用于科研和工業(yè)生產(chǎn)中。其中最為典型的是從水生棲熱菌(T.aquaticus)中分離純化而來的用于 PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶［6］。紅色亞棲熱菌(Meiothermus ruber)屬于革蘭氏陰性、無芽孢好熱桿菌，形成紅色菌落，生長溫度為35～70℃，最適生長溫度為60℃［7］。亞棲熱菌屬中，除M.taiwanensis有較深入的研究外，其他菌研究很少。本實驗室從云南騰沖熱海溫泉采集樣品中篩選出1株能夠降解結(jié)晶纖維素的嗜熱菌株，經(jīng)形態(tài)特征、理化性質(zhì)和16S rDNA序列同源性分析鑒定為紅色亞棲熱菌，并命名為Meiothermus ruber TC-1［8］。該菌株具有木聚糖酶活性，因此本研究主要通過設(shè)計引物從M.ruber TC-1中擴增出木聚糖酶基因，測定木聚糖酶的溫度特性和降解產(chǎn)物，并對該酶進行生物信息學(xué)分析，為研發(fā)具有應(yīng)用價值的木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅色亞棲熱菌Meiothermus ruber TC-1(CICIM B7007)由本實驗室分離和保存，Escherichia coli DH5α購自Novagen(Billerica，MA，USA)。蛋白酶K、Ex-Taq DNA聚合酶和rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNase、DNA Marker、Protein Marker、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，pHsh-T質(zhì)粒來自Shine E Biotech(中國南京)。2種細菌的生長使用LB培養(yǎng)基，1 000 ml液體LB培養(yǎng)基中含蛋白胨(Trypton)10 g，酵母粉(Yeast Extract)5 g，NaCl 10 g，121℃高壓滅菌20 min。液體LB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂制備固體LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株木聚糖酶活性測定 取500 μl實驗室保存的紅色亞棲熱菌TC-1菌液，涂布于斜面篩選培養(yǎng)基(含1%木聚糖、3%瓊脂的LB培養(yǎng)基)，以不添加木聚糖的斜面培養(yǎng)基作對照，60℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長狀況。挑選具有透明圈的菌落進行液體發(fā)酵，取上清液測定酶活性。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 M.ruber TC-1基因組文庫構(gòu)建和測序工作由Beijing Genomics Institute完成。將 M.ruber TC-1中木聚糖酶基因序列(GenBank accession no. JRGA01000001.1，GL000978)導(dǎo)入信號肽分析軟件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，獲知其融合一段含19個氨基酸的信號肽。根據(jù)去除信號肽的木聚糖酶基因序列設(shè)計引物:xyn-fw (5′-TTTGTATGGGCCCAGCCCGGCCC-3′)，xyn-rev (5′-CTCCGGTTGTTGTAAGGTGCGCTG-3′)。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.3 木聚糖酶基因(Mru)PCR擴增與克隆 根據(jù)堿裂解法提純紅色亞棲熱菌TC-1基因組DNA，以其為模板，xyn-fw和xyn-rev為引物擴增去除信號肽的木聚糖酶基因片段，PCR反應(yīng)程序為:95℃5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃60 s，30個循環(huán);72℃5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后，連接到pHsh-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(自制)，涂布于含25 μg/ml氯霉素的固體LB培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)，然后篩選單菌落進行PCR驗證和送上海生物工程公司測序。

1.2.4 重組酶粗酶液制備及酶活力測定 挑取含有重組質(zhì)粒 pHsh-xyn的陽性轉(zhuǎn)化子接入含 25 μg/ml氯霉素的3 ml LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達0.6～0.8后，立即轉(zhuǎn)入42℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)6～10 h，培養(yǎng)結(jié)束后，以6 000 r/min離心2 min收集菌體，用2 ml無菌水重懸細胞，然后在冰水浴中用超聲破碎儀破碎菌體，每個循環(huán)超聲9 s，冷卻5 s，運行2 min，細胞破碎液經(jīng)10 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為粗酶液。木聚糖酶活性的測定以1%燕麥木聚糖為底物，方法為:往90 μl 50 mmol/L pH 6.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中加入0.1 ml底物和10 μl酶液，65℃水浴10 min，反應(yīng)完成后往體系中加入600 μl PAHBAH溶液［0.5 mol/L NaOH和溶于0.5 mol/L HCl的5%PAHBAH儲存液4∶1(體積比)］終止反應(yīng)，最后將混合物沸水浴10 min，冰水冷卻后，測定410 nm光吸收值。木聚糖酶活性單位定義為在上述試驗條件下，每分鐘催化反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol木糖的使用酶量。

1.2.5 木聚糖酶解產(chǎn)物分析

1.2.5.1 酶解液制備 用50 mmol/L pH 6.0緩沖液配制濃度為0.5%的燕麥木聚糖溶液，取出200 μl加入50 μl木聚糖酶(20 U/ml)，65℃保溫12 h。向酶解液中加入等體積無水乙醇沉淀未水解的大分子聚合物和酶蛋白，10 000 g離心5 min去除沉淀，將上清液風(fēng)干后再加入100 μl無菌水重新溶解水解產(chǎn)物。

1.2.5.2 TLC法測定酶解產(chǎn)物 薄層板購自Merck公司，型號為 60 F254。展開劑為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(體積比)，顯色劑為濃硫酸∶甲醇=2∶8(體積比)和100 mg 5-甲基-1，3-苯二酚。展開劑距離頂部2 cm時停止展層，取出薄層板自然風(fēng)干，再均勻噴上顯色劑，于85℃顯色。

1.2.6 木聚糖酶(Mru)的生物信息學(xué)分析 一級結(jié)構(gòu)分析:保守區(qū)和蛋白家族分析預(yù)測采用在線CCD和Pfam程序(http://pfam.sanger.ac.uk/)結(jié)合BlastP，氨基酸序列推測采用 http://www.biosoft.net/sms/，信號肽分析使用 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/服務(wù)器，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析預(yù)測采用ProParam服務(wù)器http://www.expasy.ch/tools/，將氨基酸序列輸入NCBI進行在線“tblastP”同源性檢索，采用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，計算方法為鄰位相連法(Neighbor joining)，并運用自展內(nèi)部分枝法(Bootstrapping)來評定進化樹的置信度，重復(fù)次數(shù)為1 000。二級結(jié)構(gòu)分析:蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測采用在線工具SOPMA(https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)，疏水性分析在線服務(wù)器http://web.expasy.org/protscale/。同源建模:蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 http://www.rcsb.org/pdb/home/ home.do;蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析預(yù)測使用Modeller軟件;同源建模評價 http://services.mbi.ucla.edu/ SAVES/。

2 結(jié)果

2.1 木聚糖酶基因Mru克隆

根據(jù)堿裂解提取基因組方法，得到 M.ruber TC-1基因組DNA，然后使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果(圖1a)。以M.ruber TC-1的基因組DNA為模板，用引物xyn-fw和xyn-rev PCR擴增M.ruber TC-1基因組中的木聚糖酶DNA片段，得到約950 bp大小的片段，與預(yù)期目的基因長度一致(圖1b)。測序結(jié)果表明，其開放閱讀框的長度為951 bp，序列與紅色亞棲熱菌 DSM1279木聚糖酶(登錄號為WP_015586289.1)一致性達100%。

2.2 重組木聚糖酶的表達及溫度特性

將空載質(zhì)粒pHsh轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α和攜帶木聚糖酶基因的pHsh-xyn質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α的表達結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳對比分析，得出重組酶木聚糖酶蛋白大小約為36 000(圖2)。在65℃下，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度設(shè)定為 50 mmol/L，pH 4.5～8.5，測得木聚糖酶最適反應(yīng)pH為6.0。在pH為6.0的條件下，將反應(yīng)體系分別以55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃保溫10 min，酶活性測定結(jié)果如圖3，由圖3可知，木聚糖酶Mru最適反應(yīng)溫度為65℃，但在55～70℃范圍內(nèi)酶活性均很高，在75℃酶活性仍達最大酶活性的60%左右。在pH6.0、溫度為65℃條件下，重組木聚糖酶粗酶液的比酶活性為20 U/ml。

2.3 木聚糖酶的水解產(chǎn)物

以燕麥木聚糖為底物，將木聚糖酶Mru的水解產(chǎn)物同其他已報道的1個第10家族來自Thermotoga maritima的木聚糖酶B［9］和2個第11家族分別來自Bacillus pumilus ARA［10］和Thermomyces lanuginosus［11］的木聚糖酶的水解產(chǎn)物對比分析(圖4)。木聚糖酶Mru和木聚糖酶B對燕麥木聚糖的水解產(chǎn)物主要是木糖和木二糖;Bacillus pumilus ARA木聚糖酶對燕麥木聚糖的主要水解產(chǎn)物是木糖、木二糖和木三糖;Thermomyces lanuginosus木聚糖酶對燕麥木聚糖的主要水解產(chǎn)物是木二糖。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis

圖2 SDS-PAGE分析重組表達的木聚糖酶Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant xylanase

圖3 溫度對木聚糖酶Mru活性的影響Fig.3 Effect of temperature on Mru xylanase activity at pH6.0

2.4 木聚糖酶Mru的生物信息學(xué)

2.4.1 木聚糖酶Mru一級結(jié)構(gòu)

2.4.1.1 保守區(qū)預(yù)測 利用NCBI中的BlastP和CCD程序以及Pfam對序列測序結(jié)果進行保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測。木聚糖酶Mru具有第10家族糖基水解酶的保守區(qū)域，位于Leu18～Leu317。

圖4 不同來源木聚糖酶水解燕麥木聚糖的產(chǎn)物Fig.4 Thin-layer chromatography of the products from the hydrolysis of oat spelt xylan

2.4.1.2 木聚糖酶Mru同源性分析 通過Gen-Bank數(shù)據(jù)庫的Blastp程序，對木聚糖酶Mru序列測定結(jié)果進行同源性分析，結(jié)果顯示其與來源M.ruber DSM1279(WP_015586289.1)的木聚糖酶一致性為 100%，與來源 Meiothermus cerbereus(WP_ 027878488)、Meiothermus rufus(WP_027881275)、Meiothermus chliarophilus(WP_027891604)、Meiothermus timidus(WP_018467010)的木聚糖酶一致性分別為89%、78%、65%、61%。選取表1中14種已有報道的第10家族木聚糖酶進行序列相似性比對分析，結(jié)果表明，木聚糖酶Mru具有第10家族木聚糖酶通常所包含的2個谷氨酸催化殘基E150和E255，這2個殘基被認為在木聚糖酶催化反應(yīng)中具有重要作用［12-13］。另外，比對的14個木聚糖酶有5個高度保守區(qū)，即靠近N端的ENVMKW、GHTLVWH、WDVVNE、YNDY以及TELD。根據(jù)酶的溫度耐受性，木聚糖酶可劃分為中溫酶(40～60℃)、高溫酶(50～80℃)和超高溫酶(＞80℃)［14］，耐受性低于40℃的酶稱為低溫酶。對14個木聚糖酶進行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖5)表明，木聚糖酶Mru與7種高溫酶聚為一類，另2種高溫酶(Tthx、Tspx)與4種低溫酶聚為另一類。

表1 14個第10家族木聚糖酶的溫度特性Table 1 Temperature characters of 14 GH10 xylanases

圖5 對14種第10家族木聚糖酶系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 The phylogenetic tree of 14 GH10 xylanases

2.4.2 木聚糖酶Mru二級結(jié)構(gòu) 木聚糖酶Mru的疏水性最大值是1.478，位于第26位點處。疏水性最小值是-2.133，位于第263位點處。從圖6可以看出親水性氨基酸殘基均勻分布于整條肽鏈，且多肽鏈整體疏水值小于零，該蛋白表現(xiàn)為一定的親水性。經(jīng)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析得出，木聚糖酶Mru不穩(wěn)定系數(shù)是39.40，脂肪系數(shù)為90.22，疏水性平均值為-0.234，表明木聚糖酶Mru是穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖6 重組木聚糖酶Mru疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity analysis of recombinant Mru xylanase

由于肽鏈內(nèi)部和多肽鏈之間的氫鍵，肽鏈在一維方向展示出許多周期性的結(jié)構(gòu)，如α-螺旋、β-折疊等。通過SOPMA分析預(yù)測木聚糖酶Mru的二級結(jié)構(gòu)，Mru木聚糖酶是由51.68%α-螺旋，15.90%β-折疊，7.34%β-轉(zhuǎn)角，25.08%無規(guī)則卷曲組成(圖7)。

圖7 木聚糖酶Mru二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of Mru xylase

2.4.3 木聚糖酶Mru同源建模 為了提高同源建模的可信度，采用多序列比對同源建模方法。使用Blast工具在PDB數(shù)據(jù)庫搜索相似的序列之后，選擇4個同源性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。將這4個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板，應(yīng)用Modeller構(gòu)建目標序列構(gòu)象，結(jié)構(gòu)如圖8。利用PROCHECK對目標蛋白質(zhì)模型進行合理性分析，模建的三維結(jié)構(gòu)96% 氨基酸的ψ角和φ角位于Ramachandran圖的合理區(qū)域，表明構(gòu)建的木聚糖酶Mru蛋白催化域的三維結(jié)構(gòu)是合理的。進一步利用verfy3D軟件檢測模建結(jié)果的三維結(jié)構(gòu)(3D)與序列結(jié)構(gòu)(1D)的符合度，表明93.38%殘基的3D與1D符合度大于0.2，處于可接受水平。木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)為(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)。同源比對得到的5個保守區(qū)ENVMKW、GHTLVWH、WDVVNE、YNDY和TELD分別分布在木聚糖酶Mru蛋白的空間結(jié)構(gòu)中的β2末端、β3末端、β4部分、β5部分和β7部分，位于(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁。酸堿催化活性氨基酸E150位于β4折疊的尾巴上，另外一個谷氨酸催化殘基(E255)位于β7上。從木聚糖酶Mru蛋白CD區(qū)三維結(jié)構(gòu)可以看出，α螺旋幾乎不含有保守氨基酸殘基，保守性遠低于β折疊。催化位點位于β折疊區(qū)有利于保持酶的熱穩(wěn)定性，同時β折疊區(qū)的高度保守性說明了嗜熱酶在進化過程中形成了獨特的熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)模式。

圖8 木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)Fig.8 Overall structure of the CD domain of Mru xylanase predicted by Modeller

3 討論

本研究從亞棲熱菌中成功克隆出了木聚糖酶基因，通過蛋白的一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)分析，初步論斷該酶屬于第10家族，且是一個較穩(wěn)定的親水蛋白。以往許多研究者通過晶體結(jié)構(gòu)分析、序列比對和突變研究結(jié)果說明中溫酶和耐熱酶一級結(jié)構(gòu)上很相似，于是推測影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素是蛋白分子進行了一些微小的修飾，如二硫鍵、鹽鍵、氫鍵、表面帶電殘基及內(nèi)部堆積力等，同時提出了各種理論，如疏水核堆積或芳香族氨基酸粘性斑形成多聚體，脯氨酸規(guī)則，螺旋偶極子的穩(wěn)定，熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(TSD)等［28］。本研究對已研究較深入的4種中低溫木聚糖酶，9種耐熱木聚糖酶和木聚糖酶Mru進行同源性比對，這些酶均屬于第10家族木聚糖酶。分析得到的結(jié)果是，木聚糖酶Mru具有通常第10家族木聚糖酶所包含的2個谷氨酸催化殘基E150和E255，有5個高度保守區(qū)，即靠近N端的ENV MKW以及GHTLVWH、WDVVNE、YNDY、TELD，而且木聚糖酶Mru在進化樹上體現(xiàn)出與其他耐熱木聚糖酶具有類似的進化過程。木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)為(β/α)8桶裝結(jié)構(gòu)。催化位點位于β折疊區(qū)有利于保持酶的熱穩(wěn)定性，同時β折疊區(qū)的高度保守性說明了嗜熱酶在進化過程中形成了獨特的熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)模式。另外，該木聚糖酶在65～70℃酶活性最高，說明具有良好的耐熱性，在55℃的酶活性也達到最大酶活性的70%左右。

中國存在眾多的廉價木質(zhì)纖維原料，目前對其使用方式仍然十分粗放，不可避免的造成許多資源浪費和環(huán)境問題。木聚糖酶等酶制劑轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維生產(chǎn)實用產(chǎn)品，反應(yīng)溫和，效果突出，因而備受關(guān)注，但木聚糖酶在產(chǎn)業(yè)化過程中尚存在許多限制因素。第一，酶的生產(chǎn)技術(shù)水平亟需提高。木聚糖酶要達到大批量生產(chǎn)要求，目前的有效途徑是通過基因工程篩選克隆子。第二，需要篩選出產(chǎn)生耐高溫、耐酸、耐堿性木聚糖酶的微生物，從而有利于酶貯存和應(yīng)用。第三，在投入實際使用方面還要考慮如何實現(xiàn)酶的最佳性能，如根據(jù)底物種類和濃度控制用酶量、復(fù)合酶制劑的配比以及酶載體的優(yōu)化等。因此，利用生物信息學(xué)分析方法結(jié)合基因工程手段是實現(xiàn)木聚糖酶制劑批量生產(chǎn)和有效應(yīng)用的一個優(yōu)良途徑。

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