湯明杰 葉永山 張旗 蘇浬 趙躍東 曹春琪 雷海民 李強(qiáng)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接或間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，出現(xiàn)彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷所致肺水腫和肺不張、微血栓形成、微循環(huán)障礙等病理特征［1-2］。ALI發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率極高，是臨床上的急危重癥，目前尚無療效較好的藥物治療。目前研究表明肺內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的重要機(jī)制。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀功效，現(xiàn)代藥理研究表明牡丹皮具有鎮(zhèn)痛抗炎、改善血流動(dòng)力學(xué)和微循環(huán)系統(tǒng)等作用［3］，且對(duì)肺損傷有一定的保護(hù)作用［4］。因此本文從炎性細(xì)胞、促炎因子及蛋白的釋放來探討牡丹皮對(duì)ALI的干預(yù)作用，并期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～220g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):11400700019196。

1.1.2 試劑及主要儀器 牡丹皮(安國藥材市場(chǎng)，批號(hào):20130918)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為毛茛科芍藥屬植物牡丹的干燥根皮;大腸桿菌內(nèi)毒素(L2880，sigma);牛血清白蛋白(A7030，PH-7，sigma);醋酸地塞米松片(H12020363，天津柏海藥業(yè));TNF-α、IL-6試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司);吉姆薩染液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司);考馬斯亮藍(lán)G-250(北京拜爾迪生物科技有限公司)。TXD3型離心甩片機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室一起開發(fā)有限公司);MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司);Effendorf 5810R離心機(jī)(德國);BX40F4型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本);AxioCam ERC5s成像系統(tǒng)(德國蔡司數(shù)碼成像系統(tǒng))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹皮水提物制備 牡丹皮藥材，10倍量水回流提取兩次，每次2小時(shí)，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得牡丹皮水提物﹙1 mL≈0.35 g﹚。

1.2.2 ALI模型制備 將大鼠隨機(jī)均分為5組:生理鹽水對(duì)照組、模型組、陽性藥(地塞米松)組、治療組及預(yù)防組。各組分別用水合氯醛腹腔注射麻醉，除對(duì)照組以外各組分別氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)(8 mg/kg)，復(fù)制ALI模型。對(duì)照組在同樣的條件下，向氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。

1.2.3 給藥方法 預(yù)防組，在造模前3天灌胃給予牡丹皮水提物，每天一次，每次10 mL/kg。其它各組均在造模2小時(shí)后灌胃給藥，治療組給予10 mL/kg的牡丹皮水提物、地塞米松組給予地塞米松片2 mg/kg，對(duì)照組和模型組灌胃給予治療組等量的生理鹽水，各組給藥5次，每次間隔約2小時(shí)。5組動(dòng)物均在造模12小時(shí)后取材。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)百分比各組動(dòng)物隨機(jī)取8只，以腹主動(dòng)脈取血處死后，行氣管插管。用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)進(jìn)行整肺灌洗，收集BALF，4℃，1300 rmp(離心10 分鐘)，收集上清液，－80℃保存，待測(cè)蛋白及細(xì)胞因子含量。沉淀細(xì)胞用PBS稀釋混勻，進(jìn)行細(xì)胞甩片(離心甩片機(jī)，1200 rmp，3分鐘)做細(xì)胞涂片，姬姆薩(Gemsa)染色，顯微鏡下分類計(jì)數(shù)。

1.3.2 BALF中蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)BALF中蛋白濃度。

1.3.3 BALF中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)檢測(cè)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定TNF-α、IL-6的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察各組余下的3只大鼠處死后，取左肺葉，10%中性福爾馬林固定48小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡下觀察肺形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)，各組間兩兩比較采用LSD方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BALF中PMN百分比和蛋白濃度變化

模型組PMN百分比及蛋白含量均較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01);地塞米松組、治療組、預(yù)防組的PMN百分比及蛋白含量較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);預(yù)防組的指標(biāo)值稍低于治療組，但二者無顯著差異，結(jié)果見表1。表明LPS可誘導(dǎo)大鼠肺部PMN大量活化、聚集，促進(jìn)炎癥的發(fā)生、發(fā)展;大鼠 BALF中蛋白含量急劇增多，說明LPS刺激后大鼠肺泡通透性增加，肺損傷較嚴(yán)重，這些指標(biāo)均符合ALI的病理特征。另附細(xì)胞分類計(jì)數(shù)Gemsa染色涂片結(jié)果圖，見圖1。

2.2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度變化

模型組BALF中TNF-α、IL-6濃度均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);地塞米松組、治療組的TNF-α、IL-6濃度均較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);預(yù)防組的TNF-α濃度低于模型組(P＜0.01)，IL-6的濃度與模型組無差異，結(jié)果見表2。說明模型組大鼠的前炎性細(xì)胞因子含量顯著增加，符合ALI早期的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步表明用 LPS誘導(dǎo) ALI模型較成功。

表1 各組大鼠BALF中PMN百分比和總蛋白濃度( ± s，n=9)

表1 各組大鼠BALF中PMN百分比和總蛋白濃度( ± s，n=9)

注:與模型組比較，a P＜0.05，b P＜0.01。

組別 BALF中PMN百分比﹙%﹚BALF中蛋白濃度(μg/mL)對(duì)照組 8.96±2.16b 83.76±30.04b模型組 87.20±1.22 379.08±47.91地塞米松組 44.25±17.32b 251.05±53.66b治療組 65.76±1.64a 143.94±24.79b預(yù)防組 42.30±3.77b 105.44±31.39b

表2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度(± s，n=9)

表2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度(± s，n=9)

注:與模型組比較，a P＜0.05、b P＜0.01。

組別 TNF-α﹙pg/mL﹚ IL-6﹙pg/mL﹚對(duì)照組 10.44±1.09b 130.99±20.68b模型組 26.92±9.50 210.00±57.22陽性藥組 12.52±2.27a 150.44±18.11b治療組 10.97±2.99b 135.52 ±30.36b預(yù)防組 10.56±2.19b 205.60±15.15a

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

圖1 大鼠BALF中PMN涂片觀察結(jié)果﹙Gemsa染色﹚

光鏡下見NS組:肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄，肺泡隔微血管、肺泡腔及間質(zhì)隙內(nèi)少量充血，未見肺水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組:肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔變窄，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及滲出物。與模型組比較，牡丹皮干預(yù)組和地塞米松組大鼠肺組織病變明顯改善:肺組織病變局限且程度減輕，肺泡腔擴(kuò)張，肺泡間隔增厚不明顯，局部肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞及滲出物明顯減少，另外陽性藥組大鼠肺泡腔擴(kuò)張更顯著。結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果﹙HE染色，×100)

3 討論

目前研究表明，肺內(nèi)或全身過度活化的、失控性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI/ARDS的主要原因。炎性細(xì)胞主要包括肺部中性粒細(xì)胞(又稱多形核白細(xì)胞，polymorphonuclear，PMN)、肺單核巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vascular endothelial cell，PVEC)等。機(jī)體受刺激后產(chǎn)生的大量前炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1、IL-6等)及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，促使炎癥細(xì)胞(尤其是多形核白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞)在肺組織的聚集、活化，構(gòu)成了ALI炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”，繼而形成炎癥的“瀑布樣”鏈鎖反應(yīng)，致使肺血管內(nèi)皮和上皮細(xì)胞受到破壞，影響細(xì)胞間隙、鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及肺表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而大量富含蛋白的液體進(jìn)入肺組織，形成急性肺水腫，導(dǎo)致透明膜的形成以及肺泡的陷閉［5-6］。

LPS誘導(dǎo)ALI發(fā)生時(shí)的典型急性炎癥反應(yīng)，從中醫(yī)溫病角度看是“溫邪犯肺”致熱毒壅肺、血熱郁滯的表現(xiàn)，熱毒灼傷氣津、煎熬血液，則見肺毛細(xì)血管瘀血、肺間質(zhì)瘀血、液體細(xì)胞滲出、水腫、肺泡透明膜形成等［7-8］，治療時(shí)應(yīng)用清熱解毒、涼血散瘀、活血利水法［9］。牡丹皮作為傳統(tǒng)的清熱涼血藥且具活血化瘀功效，常用來治療熱毒血癥，故本研究從溫病“熱毒血癥”切入，探討牡丹皮對(duì)ALI的治療作用。結(jié)果顯示:ALI模型大鼠BALF中的PMN、蛋白濃度、TNF-α及IL-6水平在12小時(shí)急劇升高，說明ALI發(fā)生時(shí)肺內(nèi)產(chǎn)生過度、活化的炎癥反應(yīng)，造成肺損傷。牡丹皮治療及預(yù)防組大鼠BALF中的PMN數(shù)、蛋白濃度、TNF-α及IL-6水平顯著降低，肺病變程度明顯減輕，且與陽性藥地塞米松組無顯著性差異。說明牡丹皮通過抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集、活化，減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，進(jìn)而有效的抑制ALI時(shí)的炎癥反應(yīng)，減輕肺部損傷，對(duì)肺組織起到很好的保護(hù)作用。牡丹皮預(yù)防組大鼠的檢測(cè)指標(biāo)值稍低于治療組，可能與牡丹皮提高免疫力、促進(jìn)抗炎作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明清熱涼血藥牡丹皮可以有效地防治急性肺損傷，其機(jī)理可能與抑制中性粒細(xì)胞的過度活化，下調(diào)促炎因子的釋放，減輕炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

志謝 感謝北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李健副教授為本課題提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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